慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞進行性死亡的線粒體機制.pdf

1、前言
　　青光眼視神經病變是全球首位不可逆致盲眼病。主要表現(xiàn)為以視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGCs)進行性丟失為病理基礎的特征性視神經損害和視野缺損。目前認為高眼壓是主要的危險因素和始動因素。然而，單純降低眼壓只能從一定程度上緩解病情的發(fā)展卻不能遏制繼發(fā)性RGCs死亡及其軸突的潰變。從而使得臨床上有效控制視神經病變發(fā)展的手段有限。
　　青光眼和線粒體視神經病變在病理特征和臨床表現(xiàn)上的諸多相

2、似性使線粒體在青光眼視神經病變中的作用受到越來越多的重視和關注。此外，現(xiàn)已證實線粒體功能障礙在阿爾茨海默病、帕金森病等神經變性疾病中起了重要作用。青光眼也屬于神經變性類疾病，具有這些疾病的共同特點:年齡相關性、神經元選擇性、進行性丟失。這些證據(jù)都提示線粒體在青光眼發(fā)展中扮演重要角色的可能性。那么:線粒體在RGCs進行性死亡過程中發(fā)生了哪些改變？是否可以解釋臨床上一些患者在眼壓有效控制以后，視力損害仍然持續(xù)加重的現(xiàn)象？這些問題尚未見報道。

3、
　　線粒體被稱為細胞內的能量工廠，對于細胞的存活和死亡起著至關重要的調控作用。線粒體DNA(mtDNA)是核外唯一的遺傳物質，因其特殊的組成結構和細胞內定位使mtDNA較nDNA易受損傷、突變率高。同時，mtDNA幾乎不存在非編碼區(qū)，任何位點的突變部可能被轉錄，造成蛋白質表達改變，產生嚴重后果。
　　RGCs作為一類代謝旺盛的神經元，包體和軸突中線粒體的含量非常高。這也就決定了RGC對線粒體功能異常的敏感性。最近有學者在青

4、光眼患者外周血中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變增加和ATP合成障礙，提示mtDNA損傷及線粒體功能下降是青光眼發(fā)病的危險因素之一。然而，這些研究僅局限于患者外周血，還無法解釋青光眼視神經病變過程中RGCs和視神經進行性損傷，甚至在眼壓有效控制后視力損害仍持續(xù)加重的原因。關于青光眼視神經病變發(fā)展過程中，RGCs mtDNA的突變、可能的突變機制、以及mtDNA突變在細胞進行性死亡中的作用等問題，未見報道。
　　為此，本研究以慢性高眼壓Wista

5、r大鼠模型為對象，研究了mtDNA、mtDNA修復酶、線粒體復合物功能在高眼壓和眼壓恢復正常后的變化，并通過體外細胞培養(yǎng)實驗探討了高眼壓mtDNA突變的可能機制及mtDNA突變與線粒體功能障礙的關系。此外，還深入探討了mtDNA突變或損傷引起視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞進行性死亡的可能機制。
　　第一部分慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞mtDNA及線粒體功能變化
　　目的:以大鼠慢性高眼壓大鼠模型為研究對象，系統(tǒng)研究在高眼壓期間和眼壓恢復正常

6、后RGCs的丟失特征，以及RGCs中mtDNA損傷與突變、mtDNA修復能力、線粒體功能的動態(tài)變化。初步揭示mtDNA異常在青光眼RGCs死亡中的重要性。
　　方法:選用8周齡Wistar大鼠，通過鞏膜上靜脈燒灼(EVC)方法建立慢性高眼壓模型。熒光金逆行標記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片觀察、計數(shù)RGCs的存活數(shù)量。SMI32免疫熒光標記視神經觀察其丟失情況。采用免疫吸附的方法分離純化RGCs后抽提線粒體、mtDNA、nDNA、線粒體蛋白

7、、細胞漿蛋白、總mRNA。以long-extensionPCR方法檢測mtDNA損傷、DNA隨即突變捕獲的方法檢測mtDNA突變率、westernblot和realtime PCR方法檢測mtDNA修復酶OGG1、MYH和POLG的表達、生化方法檢測線粒體功能，包括線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率和ROS含量。
　　結果:80％術眼在EVC術后1天時眼壓升高，平均值為25.3+1.6 mmHg，在這些眼中高眼壓能持續(xù)至6周者

8、約占35％(18.7±+1.1 mmHg)。術后6-7周因血管再通導致眼壓逐步降至正常，直至6個月實驗結束。對側假手術眼眼壓穩(wěn)定維持在12.16±0.89mmHg。RGCs計數(shù)發(fā)現(xiàn)不僅在高眼壓期間其數(shù)量持續(xù)減少，眼壓恢復正常后仍進行性下降，術后2、4、6個月RGCs丟失的比例依次為24.6±0.17％(p＜0.05)、30.4±0.78％(p＜0.01)和34.8±0.15％(p＜0.01)。SMI32陽性染色定量分析也證實軸突在眼壓恢

9、復正常后的6周至6月期間繼續(xù)丟失了12％。EVC術后2周檢測到mtDNA損傷，并不斷增加，但在高眼壓期間與對照組相比無統(tǒng)計學意義。眼壓恢復正常后繼續(xù)呈進行性加重趨勢，于2、4、6個月時檢測mtDNA損傷分別是對照組的1.5倍(p＜0.05)、2.8倍(p＜0.01)和3.4倍(p＜0.01)。mtDNA突變隨機捕獲實驗進一步證實了這個結果:眼壓增高后2-4周可檢測到mtDNA突變增多，眼壓恢復正常后，突變未見減少反而繼續(xù)增加，術后2、4

10、、6個月Taq11427位點的突變率分別是對照組的7.6倍(p＜0.05)、10.3倍(p＜0.01)和16.8倍(p＜0.01);Taq18335位點mtDNA突變率在術后6周和6月分別是對照組的9.9倍(p＜0.01)和12.7倍(p＜0.01)。高眼壓后RGCs的mtDNA修復酶OGG1、MYH和POLG在線粒體內表達下降，即使眼壓恢復正常仍未見緩解。而mRNA表達卻表現(xiàn)出與蛋白表達的不一致，眼壓升高后迅速增多，隨后逐漸下降，但O

11、GG1和MYH始終未降至正常水平以下。高眼壓后RGCs中線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ的活性與對照組相比下降，其中復合物Ⅰ在6周、2、4、6月時下降36％，(p＜0.05)、39％(p＜0.05)、41％(p＜0.05)和43％(p＜0.05);復合物Ⅲ下降更明顯，第2周下降35％(p＜0.05)，4月和6月時分別下降了56％(p＜0.01)和62％(p＜0.01)。術后6月時復合物Ⅰ和Ⅲ中由mtDNA編碼的亞基cyt B和ND5的蛋白含量仍顯著減

12、少。RGCs內線粒體ATP生成率在眼壓升高后出現(xiàn)一過性增高，是對照組的5.2倍(p＜0.01)，隨即下降，眼壓恢復正常后仍未改善，至6個月實驗結束時下降了48％，差異出現(xiàn)顯著性(p＜0.05)，表現(xiàn)為不可逆性減少。ROS在眼壓升高后1周迅速升高，1周時達到峰值（為對照組1.6倍，p＜0.05）。隨后ROS含量快速下降直至正常。術后4個月和6個月時檢測到ROS含量再次升高。
　　結論:高眼壓持續(xù)6周后，即使眼壓恢復正常，RGCs及其

13、軸突仍呈進行性丟失;高眼壓后，RGCs線粒體DNA損傷和突變增加，且在眼壓恢復正常后仍進行性、累積性加重，伴隨mtDNA修復能力持續(xù)低下和線粒體功能不可逆性障礙。
　　第二部分壓力對線粒體DNA損傷及功能影響的體外研究
　　目的:明確壓力是否可以引起mtDNA的損傷和突變，探討mtDNA突變和損傷與線粒體功能障礙的關系。
　　方法:為在體外模擬慢性高眼壓狀態(tài)，本實驗采用加壓培養(yǎng)大鼠腦星形膠質細胞，壓力設定為30mmHg

14、。于加壓后12、24、48、72、96和120小時收集細胞，利用long-extension PCR和隨機突變捕獲實驗檢測mtDNA的損傷和突變。Real-timePCR和westeren blot方法測定mtDNA修復酶OGG1、MYH和POLG的表達。DCF-DA方法檢測ROS含量。Lenti-shPOLG轉染星形膠質細胞誘導mtDNA損傷和突變的細胞模型，western blot檢測由mtDNA編碼的線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ的亞基ND4

15、、ND5、ND6和cyt B的蛋白含量。進而采用生化方法檢測復合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率，JC-1熒光探針測定線粒體膜電位的變化。
　　結果:加壓24小時即可檢測到mtDNA損傷增加，72小時較對照組增加＞40％(p＜0.05)。加壓48小時后Taq11427位點突變增加，是對照組的2.2倍(p＜0.05)，120小時達到5.1倍(p＜0.001)。Taq18335位點突變增加趨勢與Taq11427一致，120小時達到對照組的

16、4.9倍(p＜0.001)。加壓后細胞ROS含量未見顯著改變。OGG1、MYH和POLG的mRNA表達在加壓后迅速升高，12小時達到峰值，分別是對照組的11.2倍(p＜0.01)、6.3倍(p＜0.05)和1.8倍(p＜0.05)。隨后OGG1、MYH逐漸恢復正常直至120小時，而POLG則持續(xù)下降至正常水平以下。線粒體內OGG1、MYH和POLG蛋白表達在加壓后48小時開始下降，于72小時和120小時分別下降了56％(p＜0.05)、

17、60％(p＜0.01);38％(p＜0.05)、63％(p＜0.01)和39％(p＜0.05)、37％(p＜0.05)。細胞轉染Lenti-shPOLG后5天和10天，mtDNA損傷較對照組分別增加了16％(p＞0.05)和46％(p＜0.01)。mtDNA編碼的線粒體復合物亞基ND5、ND6和cyt B的蛋白表達顯著下降，與對照組相比分別下降43％(p＜0.05)、32％(p＜0.05)和34％(p＜0.05)。復合物Ⅰ和Ⅲ的活性在轉

18、染后10天時分別下降22.6％(p＜0.05)和40.8％(p＜0.05)，線粒體膜電位下降了63％(p＜0.001)。轉染后第9天ATP生成率是對照組的67.9％(p＜0.05)，顯著減少。
　　結論:異常升高的壓力可以直接導致mtDNA損傷和突變，一方面直接導致了線粒體功能障礙;另一方面，mtDNA損傷和突變又可造成線粒體膜電位下降，從而引起mtDNA修復酶表達下降，三者可形成惡性循環(huán)，最終使mtDNA損傷和突變進行性、累積性

19、加重。
　　第三部分 mtDNA損傷和突變加重視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞的易損性
　　目的:通過建立RGCs mtDNA損傷和突變的動物模型，研究mtDNA損傷和突變增多后RGCs的凋亡情況，以及對青光眼常見損傷因素如眼壓升高和谷氨酸濃度增加的敏感性。
　　方法:設計三條shPOLG模版DNA，以pSilencer1.0-U6為載體構建shPOLG和對照質粒，real-time PCR和westernblot方法檢測POLG的表

20、達，篩選出抑制效率最佳的質粒并將其克隆到pAAV-CMV-GFP載體中，構建AAV2-shPOLG載體、擴增、純化。Wistar大鼠玻璃體腔注射AAV2-shPOLG建立RGCs mtDNA損傷和突變模型。注射后2、6、12個月western blot檢測RGCs中POLG蛋白表達、LX-PCR和mt突變隨機捕獲實驗檢測mtDNA損傷和突變，DCF-DA法檢測ROS含量，明確建模是否成功。取注射后12個月的大鼠視網(wǎng)膜下注射谷氨酸或行鞏膜

21、上靜脈燒灼手術(EVC)，1周后處死大鼠，進行視網(wǎng)膜TUNEL原位檢測，DiI逆行標記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片計數(shù)存活RGCs數(shù)量。Western blot檢測RGCs中裂解的caspase-3的含量，以明確RGCs的死亡是否屬于凋亡。
　　結果:AAV2-shPOLG玻璃體腔注射后2、6、12個月，mtDNA損傷較對照組增加21％、31％(p＜0.01)和63％(p＜0.01)，Taq11427位點突變率分別是對照組的6.5倍(p＜

22、0.001)、9.3倍(p＜0.001)和17.1倍(p＜0.001)。RGCs中ROS含量未見顯著改變。TUNEL結果顯示:rAAV2-shPOLG組中RGCs凋亡數(shù)量是對照組的2.3倍(p＜0.05); rAAV2-shPOLG聯(lián)合EVC組和rAAV2-shPOLG聯(lián)合谷氨酸組中RGCs凋亡數(shù)量分別較相應的對照組增加了21％(p＜0.05)和35％(p＜0.01)。裂解的caspase-3含量在rAAV2-shPOLG、rAAV2-