壓力通過介導(dǎo)ATF3表達(dá)引起大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞早期凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　青光眼(Glaucoma)是一組疾病晚期以特征性視神經(jīng)凹陷和視野缺損為共同表現(xiàn)的不可逆性、致盲性眼病，嚴(yán)重危害人類的健康和生命質(zhì)量，影響全球大約70萬人。以往，青光眼的早期診斷依賴于眼壓的升高，視野的損害和眼底的改變?nèi)笾笜?biāo)，但是現(xiàn)已證實，在青光眼患者視野出現(xiàn)特征性改變之前，其RGC軸突的30％-50％已經(jīng)受損，并且只有大量視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiberlayer，RNFL)缺損后，臨床才能檢

2、測到相應(yīng)的眼底及視野的改變。由此可見，探討青光眼損傷的早期機(jī)制對于疾病的診斷和治療意義重大，尤其對于正常眼壓性青光眼和開角型青光眼。目前普遍認(rèn)為高眼壓(intraocular pressure，IOP)是加速青光眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡的最顯著危險因素，體外培養(yǎng)的細(xì)胞系給予高液體靜壓(elevated hydrostatic pressure，EHP)通常被用來作為青光眼的細(xì)胞模

3、型。已有報道研究證實在高眼壓大鼠模型和青光眼患者中RGCs的死亡方式為凋亡。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。細(xì)胞凋亡涉及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，是一個需要一系列酶參與的級聯(lián)反應(yīng)，涉及不同基因的表達(dá)及調(diào)控、信號傳導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄激活因子3(activating transcription factor3，ATF3)作為壓力應(yīng)答反應(yīng)的早期基因，有研

4、究顯示，在大鼠的HIOP和鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注模型中，其mRNA表達(dá)在損傷早期明顯上調(diào)，且與損傷程度成線性正相關(guān)，而與此同時，尚未檢測到凋亡信號標(biāo)志物的明顯改變。另外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有研究證實，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)（如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及

5、凋亡等）。研究表明，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時JNKs信號通路是軸突損傷后引起RGCs死亡的主要的早期信號通路。綜上所述，為了明確壓力引起RGCs凋亡的早期分子機(jī)制，同時探索ATF3和MAPKs尤其是JNKs通路與青光眼早期損傷的關(guān)系，設(shè)計并展開了研究。首先本實驗通過體外培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，給予不同大小的靜水壓處理，檢測其凋亡率和各種因子的表達(dá)，明確

6、能夠引起RGC-5早期凋亡的壓力值和作用時間;然后進(jìn)一步通過給予ATF3siRNA和不同濃度的JNKs通路抑制劑(SP600125)干擾后，再檢測細(xì)胞早期凋亡率和相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，明確二者在靜水壓引起的RGCs早期凋亡中的作用，進(jìn)一步明確靜水壓引起RGC-5早期凋亡的分子機(jī)制。具體實驗分為:
　　1、時間-壓力-早期凋亡曲線的描繪:
　　通過給予體外培養(yǎng)的RGC-5不同的靜水壓處理，分別為0、20、25、30、35、40、45

7、、50、55、60、65、70mmHg，明確引起RGC-5早期凋亡的壓力值。
　　2、ATF3 siRNA的作用研究:
　　選取有效的ATF3 siRNA干擾RGC-5中ATF3 mRNA的表達(dá)，探討siRNA ATF3對RGC-5早期凋亡及ATF3、c-Jun和Jun-B表達(dá)的影響。
　　3、JNKs通路抑制劑的作用研究:
　　在前兩部分實驗的基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用特異性JNKs通路抑制劑SP600125，深入探討靜

8、水壓引起RGC-5早期凋亡的機(jī)制和ATF3、c-Jun和Jun-B的表達(dá)變化。
　　方法：
　　1、時間-壓力-凋亡曲線的描繪:
　　體外培養(yǎng)RGC-5，給予不同的靜水壓處理24小時，通過流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率，繪制時間-壓力-凋亡曲線，明確引起細(xì)胞凋亡的靜水壓值，Real-time PCR檢測ATF3、Jun-B和c-Jun mRNA的表達(dá)，Western Blot和免疫細(xì)胞組化檢測ATF3、Jun-B和c-Jun

9、蛋白的表達(dá)。
　　2、ATF3 siRNA的作用研究:
　　構(gòu)建三種不同siRNA，Real-time PCR檢測siRNA和lipo2000的用量和有效干擾ATF3 mRNA表達(dá)的siRNA，根據(jù)第一部分實驗選取的壓力值瞬時轉(zhuǎn)染，用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率，Real-time PCR、Western Blot檢測ATF3、Jun-B和c-JunmRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　3、JNK通路抑制劑(SP600125)的

10、作用研究:
　　不同靜水壓下分別添加不同濃度的特異性JNK通路抑制劑SP600125，用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率，Real-time PCR、Western Blot檢測ATF3、Jun-B和c-JunmRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬㏑GC-5對不同靜水壓的反應(yīng):RGC-5在靜水壓梯度下早期凋亡率的實驗研究:
　　1、不同靜水壓對RGC-5早期凋亡的影響:
　　不同靜水壓作用24h后引起R

11、GC-5早期凋亡，不是簡單的線性關(guān)系，而呈現(xiàn)“三峰”曲線，即在20、40和70mmHg有顯著的凋亡高峰;
　　2、不同靜水壓引起ATF3、Jun-B和c-Jun的表達(dá)變化:
　　靜水壓引起ATF3、Jun-B和c-Jun的表達(dá)增加，同樣呈現(xiàn)“三峰曲線”，不同的是ATF3峰值為20、40和70mmHg，而Jun-B和c-Jun的峰值為30、55和70mmHg;在20、40和70mmHg壓力時，三種因子mRNA的表達(dá)量隨著壓力的

12、升高而增加。
　　（二）ATF3 siRNA在靜水壓引起RGC-5早期凋亡中的作用研究:
　　1、有效siRNA的選取和劑量選擇:
　　siRNA ATF3能夠能夠有效降低RGC-5中ATF3 mRNA的表達(dá)，同時作用的最佳劑量為2μL siRNA+0.5μL lipo2000;
　　2、siRNA ATF3在不同靜水壓下對RGC-5早期凋亡的影響:
　　siRNA ATF3-Rat-651(651)有效降

13、低靜水壓引起的RGC-5早期凋亡，且在20和40mmHg作用明顯;
　　3、siRNA ATF3在不同靜水壓下對ATF3、Jun-B和c-Jun mRNA表達(dá)變化的影響:
　　siRNA ATF3-Rat-651(651)轉(zhuǎn)染后，20和40mmHg時ATF3和Jun-B mRNA表達(dá)降低，70mmHg表達(dá)增加;c-Jun mRNA在轉(zhuǎn)染組表達(dá)均增加;
　　4、siRNAATF3在40mmHg靜水壓下對ATF3、Jun-

14、B和c-Jun蛋白表達(dá)變化的影響:
　　siRNA ATF3-Rat-651(651)轉(zhuǎn)染后，ATF3的蛋白表達(dá)量降低;Jun-B和c-Jun蛋白表達(dá)量增加;
　　（三）JNK通路抑制劑(SP600125)在靜水壓引起RGC-5早期凋亡中的作用研究:
　　1、SP600125在不同靜水壓下對RGC-5早期凋亡的影響:
　　SP600125在20、40和70mmHg壓力下均降低RGC-5早期凋亡率，同時呈現(xiàn)劑量依賴

15、關(guān)系，即隨著濃度的升高凋亡率降低;同時在20和40mmHg下明顯保護(hù)RGC-5不受靜水壓損傷;
　　2、SP600125在不同靜水壓下對ATF3、Jun-B和c-Jun mRNA表達(dá)變化的影響:
　　SP600125引起ATF3、Jun-B mRNA的表達(dá)降低，c-Jun mRNA的表達(dá)均增加;
　　3、SP600125在40mmHg靜水壓下對ATF3、Jun-B和c-Jun蛋白表達(dá)變化的影響:
　　SP6001

16、25濃度為20uM時三種因子的蛋白表達(dá)量降低，尤其以ATF3更明顯。
　　結(jié)論：
　　1、壓力可以導(dǎo)致RGC-5凋亡，并且呈“三峰曲線”，即在20、40和70mmHg是凋亡明顯增加;
　　2、ATF3和Jun-B促進(jìn)靜水壓引起的RGC-5凋亡，而c-Jun則保護(hù)靜水壓引起的RGC-5凋亡;
　　3、ATF3 siRNA在靜水壓引起的RGC-5早期凋亡中起保護(hù)作用;
　　4、JNK通路參與靜水壓引起的RGC-