PEDF對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系SO-Rb50的體外作用研究.pdf

1、本研究擬用本中心建立的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系SO-Rb50研究PEDF對Rb的作用：包括：1)PEDF對SO-Rb50是否也有誘導分化的作用2)PEDF對SO-Rb50是否具有直接抑制和促凋亡的作用3)PEDF是否能下調SO-Rb50血管增生因子一血管內皮生長因子VEGF的表達。從而從體外水平證實PEDF對視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療價值，為RB保守治療提供一種新的思路。 一、研究目的 通過從體外水平觀察PEDF對SO-Rb50分

2、化、增殖、凋亡及VEGF表達的的作用初步了解PEDF治療視網(wǎng)膜母細胞瘤的潛在價值，為Rb保守治療提供一種新的安全有效的途徑。 二、實驗方法 1、通過倒置顯微鏡和免疫組化方法觀察50ng/ml PEDF對SO-Rb50細胞分化的作用，從形態(tài)學和免疫標志方面來鑒定PEDF對其誘導分化作用。 2、通過MTT法來檢測PEDF對SO-Rb50增殖的影響，設置0、6.25、12.5、25、50、100、200nM PEDF處

3、理濃度。 3、通過PI和Annix V-FITC法檢測200nM PEDF對SO-Rb50凋亡的影響，同時設置陰性對照組(0 nM PEDF)和陽性對照組VCR。 4、通過RT-PCR和免疫組化法檢測在常氧和低氧條件下PEDF對SO-Rb50VEGF表達的影響。 三、實驗結果 1、用含50ng/ml的PEDF培養(yǎng)處理7天后，將SO-Rb50細胞接種于用多聚賴氨酸處理的六孔板中，細胞開始貼壁生長，細胞變扁平

4、，體積變稍大。自接種第1天開始細胞呈單層貼壁或局部小團狀或花環(huán)狀生長，細胞逐漸由圓形向梭形生長，伸出偽足樣細小的突起，成團生長的細胞于邊緣處見細胞伸出突起。隨著培養(yǎng)時間的延長，突起逐漸變粗變長；而對照組僅在貼壁早期部分出現(xiàn)突起，中晚期并無繼續(xù)分化的趨勢。誘導前后SO-Rb50細胞均表達NSE和NF-200，分化后的細胞較分化前表達明顯增強。 2、用含6.25、12.5、25、50、100、200nMPEDF的培養(yǎng)液孵育SO-Rb

5、50細胞48小時后，MTT檢測各處理組平均OD值分別為1.099±0.147、1.190±0.147、1.344±0.452、1.102±0.351、1.007±0.269、1.037±0.175，各濃度處理組與對照組(1.030±0.090)相比無明顯差異(p>0.05)，PEDF對RB細胞增殖作用與PEDF濃度也無劑量依賴性關系(F=1.257，p>0.05)。 3、采用Annix V-FITC/PI雙染法檢測處理24小時后

6、的各樣本凋亡數(shù)，結果見200nM PEDF處理組早期凋亡和晚期凋亡細胞總分數(shù)約為3.3﹪左右，與陰性對照組(約2.5﹪)相比無明顯差異，凋亡分期也無明顯差別，而與陽性對照組(約為14.1﹪)相比，有明顯差異。 4、RT-PCR結果顯示在常氧條件下未加PEDF和加入不同濃度的PEDF處理后的Rb50細胞均表達VEGF基因，25nM、100nM、400nM PEDF處理組相對灰度值分別為0.2709±0.0911、0.2507±0.

7、0898、0.2919±0.0941，與對照組(0.2626±0.1008)相比VEGF表達均未見明顯差異(p>0.05)，且各PEDF處理濃度組間VEGF表達也無明顯差異(p>0.05)。 而在低氧條件下VEGF較常氧表達是增強的(p<0.01)，如在低氧條件下同時加入100nM PEDF處理的Rb細胞VEGF表達量與不加PEDF處理的對照組相比是減弱的(p<0.05)。 免疫組化結果顯示常氧條件加入100nM PED

8、F培養(yǎng)的細胞VEGF表達量較對照組減弱(p<0.001)，低氧條件下可見VEGF表達較常氧增強(p<0.001)，而同時加入100nM PEDF的VEGF表達量較未加入也是減弱的(p<0.001)。 三、結論 1、PEDF可以誘導SO-Rb50細胞向神經(jīng)元細胞分化，伴有神經(jīng)元標志NSE和NF-200表達的增強。 2、PEDF并無直接抑制SO-Rb50細胞增殖和誘導其凋亡的作用。 3、PEDF可以抑制SO-