肝癌細(xì)胞中RhoA小干擾RNA載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、原發(fā)性肝癌發(fā)生率高，手術(shù)切除是主要的治療方法，但肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后復(fù)發(fā)已成為影響患者預(yù)后的主要問題。肝癌侵襲轉(zhuǎn)移是主要的影響因素之一，深入研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移機制對于改善肝癌患者的總體預(yù)后有重要作用。Rho家族屬于Ras超家族，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號分子，在細(xì)胞的許多基礎(chǔ)生命活動中起關(guān)鍵的作用。Rho蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關(guān)系，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程，目前研究證實，在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、肝癌等有RhoA表達的異常增高。本研究利用

2、RNA干擾技術(shù)干擾RhoA蛋白的表達，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)，為進一步研究腫瘤細(xì)胞應(yīng)力纖維變化，變形、移動、粘附和侵襲能力改變提供實驗?zāi)Ｐ停詈罅私釸hoA和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 本研究主要包括以下兩個部分內(nèi)容： 第一部分：構(gòu)建干擾RhoA的shRNA真核表達載體。 目的：利用pGenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建針對RhoA的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達載體。 方法：設(shè)計2個shR

3、NA結(jié)構(gòu)的互補DNA序列，經(jīng)退火成雙鏈，膠回收酶切pGenesil-1大片段，T4 DNA Ligase連接酶切大片段和DNA序列，得到質(zhì)粒pGenesl-1-siRhoA1和pGenesl-1-siRhoA2.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，擴增，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。 結(jié)果：成功構(gòu)建靶向RhoA的shRNA重組質(zhì)粒載體.經(jīng)酶切鑒定和DNA測序分析，shRNA編碼序列與設(shè)計的片段完全一致，證實重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。 結(jié)論：

4、表達靶向RhoA的shRNA表達框成功構(gòu)建在重組質(zhì)粒載體上。 第二部分：肝癌細(xì)胞中RhoA小干擾RNA載體的構(gòu)建與鑒定。 目的：構(gòu)建RhoA基因的RNA干擾(RNAi)載體。 方法：根據(jù)人RhoA基因序列設(shè)計兩條短雙鏈，人工合成后，連接到人真核表達載體Pgenesil-1中，構(gòu)成Pgenesil-1-siRhoA-1 ，Pgenesil-1-siRhoA-2兩個重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)人人肝癌細(xì)胞(HEPG2)細(xì)胞中，wes