哺乳動物RNA干擾載體構(gòu)建方法研究與應(yīng)用.pdf

1、RNA干擾技術(shù)是生命科學(xué)研究中的一項不可替代的強有力的研究手段，在哺乳動物細(xì)胞中沉默目標(biāo)基因用以研究基因和蛋白質(zhì)的功能，而且在人類疾病病理學(xué)的研究中具有重要的地位。隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)的研究進(jìn)入到后基因組學(xué)的階段。在這個階段，研究者們急切的需要一些能夠適用于高通量和基因組規(guī)模的RNA干擾義庫的構(gòu)建手段來研究基因和蛋白質(zhì)的功能及相互作用，而傳統(tǒng)的RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建方法成本高、效率低、步驟繁雜、突變率高的缺點是不適合高通

2、量快速高效低成本的需求的。
　　 本研究中，我們提出了兩種新穎的快速高效的構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞RNA干擾載體的方法，目的在于解決傳統(tǒng)RNA干擾載體構(gòu)建中突變率高、成本高、效率低及步驟繁雜的問題，從而發(fā)展出適用于高通量需求的快速高效低成本的RNA干擾載體的構(gòu)建方法。第一種方法使用了GFP和ccdB基因作為篩選標(biāo)記，合成短小的引物，采用一步PCR反擴的構(gòu)建策略，形成線性的表達(dá)載體，通過大腸桿菌體內(nèi)同源重組，從而形成具有功能的RNA干擾表

3、達(dá)載體，而且重組了的篩選方法極其簡便。通過這種方法，我們構(gòu)建了五百多個表達(dá)載體，測序的準(zhǔn)確率在85％以上。第二種方法利用了lacO的特點和藍(lán)白斑篩選的原理，需要合成的引物更短。通過引物延伸的策略構(gòu)建出shRNA表達(dá)片段，然后亞克隆到骨架載體中形成具有功能的表達(dá)載體。同樣，這種方法對于重組子的篩選也是直觀簡便的。通過這種方法，我們構(gòu)建了大約120個表達(dá)載體，陽性克隆測序的準(zhǔn)確率達(dá)到80％。
　　 我們希望這些簡便、高效、低成本的方