沉默Livin基因誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、第一部分Livin基因在不同人食管癌細(xì)胞株及食管上皮細(xì)胞株中的表達(dá)及意義
　　目的：檢測(cè)Livin基因在食管上皮細(xì)胞株及不同食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并篩選出高表達(dá)Livin的食管癌細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　方法：分別采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Western blot從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè) Eca-109、TE-1、 EC9706三種食管癌細(xì)胞株及食管上皮細(xì)胞株HEEC中Livin的表達(dá)情況。

2、　　結(jié)果：qRT-PCR及Western blot顯示，在食管上皮細(xì)胞株HEEC中 Livin mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于三種食管癌細(xì)胞株(P<0.05)；qRT-PCR顯示，在上述三種食管癌細(xì)胞株中，Livin mRNA均有高表達(dá)。在 Eca-109細(xì)胞株中， Livin mRNA表達(dá)水平最高，且與 TE-1和EC9706細(xì)胞株中 Livin mRNA表達(dá)水平均存在著顯著性差異(P<0.01)。TE-1與 EC9706之間 Livi

3、n mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)；Western blot結(jié)果提示，Livin在上述三種食管癌細(xì)胞株中蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：在食管癌細(xì)胞株中 Livin的表達(dá)顯著增高；Livin在Eca-109食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)高于TE-1、 EC9706食管癌細(xì)胞株。通過篩選Eca-109細(xì)胞株可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分Livin和VEGF在食管癌組織中的表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性分析

4、r>　　目的：檢測(cè)不同臨床分期食管癌患者癌組織中，Livin與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，探討Livin和VEGF在食管癌組織中的表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性。
　　方法：使用蛋白質(zhì)免疫印跡法、免疫組織化學(xué)法和RT-PCR檢測(cè)癌組織Livin，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法和RT-PCR檢測(cè)癌組織VEGF。
　　結(jié)果：隨著食管癌的演進(jìn)，食管癌組織中Livin和VEGF的表達(dá)逐漸增高，以臨床Ⅳ期中的表達(dá)增高最為顯著(P<0.01)，V

5、EGF與 Livin表達(dá)具有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：Livin和VEGF參與了食管癌的演進(jìn)，可能成為治療食管癌的有效靶點(diǎn)之一。
　　第三部分靶向Livin的RNA干擾對(duì)食管癌凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響
　　目的：探討靶向 Livin的 RNA干擾對(duì)食管癌凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的影響。
　　方法：采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染 Livin高表達(dá)的食管癌 Eca-10

6、9細(xì)胞株，從而有效地進(jìn)行靶向Livin的RNA干擾。將Eca-109細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Livin、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：經(jīng)過靶向Livin的RNA干擾后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Livin基因mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性組明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；而與促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)的 Ca

7、spase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平較均較空白對(duì)照組和陰性組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果也提示，經(jīng)過靶向Livin RNA干擾后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中 Livin基因蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性組明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；而與促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平較均較空白對(duì)照組和陰性組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

8、.01)。
　　結(jié)論：針對(duì)Livin的RNA干擾可有效降低Livin高表達(dá)的食管癌Eca-109細(xì)胞株中Livin mRNA和蛋白水平。同時(shí)，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)分子Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白水平均明顯升高。該研究提示，針對(duì) Livin的 RNA干擾可有效升高 Caspase-3和 Caspase-9的表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。
　　第四部分RNA干擾Livin聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞Eca-1

9、09增殖和凋亡的影響
　　目的:探討RNA干擾Livin聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：首先構(gòu)建病毒載體，采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染Livin高表達(dá)的食管癌 Eca-109細(xì)胞株，并聯(lián)合順鉑進(jìn)行干預(yù)。轉(zhuǎn)染后，用分光光度法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9在405 nm外時(shí)吸光度值；XTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡；TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)改變；電鏡下觀察凋亡

10、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染后，分光光度法提示 Eca-109細(xì)胞株中 Caspase-3、Caspase-9表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；XTT結(jié)果顯示，Eca-109細(xì)胞株存活率明顯降低(P<0.01)；RNA干擾聯(lián)合順鉑干預(yù)的 Eca-109較單純順鉑干預(yù)的細(xì)胞明顯減少(P<0.01)；細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng) RNA干擾后，細(xì)胞周期主要被阻滯于S期；而相于單純順鉑干預(yù)，RNA干擾聯(lián)合順鉑可明顯增加阻滯于S期的細(xì)胞數(shù)