RNA干擾沉默食管癌細胞MMP-2基因的實驗研究.pdf

1、背景及目的：食管癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其治療效果不佳的主要原因是腫瘤的侵襲和轉移，因此針對腫瘤侵襲轉移相關的基因研究成為腫瘤研究的熱點之一?；|金屬蛋白酶-2是降解細胞外基質和基底膜的重要酶，與腫瘤侵襲、轉移和血管生成密切相關，在多種腫瘤組織中有較高的表達。RNA干擾技術是近年來產(chǎn)生的新興生物技術，可特異性地導致相應的mRNA降解，從而阻斷特定基因的表達。利用RNA干擾特異性地抑制癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達，使

2、這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療腫瘤。我們采用RNA干擾的技術，特異性抑制食管癌細胞MMP-2基因的表達，觀察食管癌細胞遷移和侵襲能力的變化，并使用基因芯片技術檢測MMP-2表達下調前后食管癌細胞基因表達譜的差異。以期進一步研究食管癌細胞侵襲轉移機制，探討控制食管癌細胞的侵襲轉移的策略以及探索食管癌基因治療的靶點。 方法： 1．對4種食管癌細胞系EC9706、KYSE510、KYSE150、TE1

3、3進行常規(guī)培養(yǎng)，采用熒光定量PCR和Western blot方法對食管癌細胞MMP-2基因在mRNA和蛋白水平的表達進行檢測，分析其表達豐度與食管癌細胞惡性程度的關系，同時篩選出高表達MMP-2細胞。 2．根據(jù)siRNA設計原則，設計合成3對靶向MMP-2基因的siRNA（siRNA-1，2，3），采用陽離子脂質體試劑瞬時轉染食管癌細胞KYSE150，利用熒光定量PCR和Western blot檢測RNA干擾后MMP-2基因的沉

4、默效果，并篩選干擾效果較好的siRNA以及適宜的轉染濃度，用于下一步實驗。 3．采用陽離子脂質體試劑向食管癌細胞KYSE150轉染靶向MMP-2基因的siRNA，下調MMP-2的表達。于轉染siRNA后48小時，應用細胞劃痕實驗檢測MMP-2基因表達下調后食管癌細胞遷移能力的變化；應用boyden chamber細胞侵襲實驗檢測MMP-2基因表達下調后，食管癌細胞KYSE150侵襲能力的改變。 4．采用陽離子脂質體試劑向

5、食管癌細胞KYSE150轉染靶向MMP-2基因的siRNA，下調MMP-2的表達。應用Affymetrix HU133 plus2基因芯片檢測食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達下調后，基因表達譜的差異，并應用生物信息學技術對相關基因和信號通路進行綜合分析。 結果： 1．4種食管癌細胞株均有MMP-2基因表達，其中低分化鱗癌細胞株KYSE150表達水平最高，與其它3種食管癌細胞株比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0．01）

6、；食管癌細胞株MMP-2基因表達豐度與食管癌細胞惡性程度有關，隨著惡性程度的上升MMP-2表達水平升高。 2．3對不同siRNA轉染組MMP-2表達在mRNA和蛋白水平均有明顯下調，其干擾效率分別為siRNA-1（97．7%）、siRNA-2（91．9%）、siRNA-3（94．9%）。其中siRNA-1干擾效率最高，與其它兩組轉染siRNA組和空白對照及陰性對照組比較，差異有顯著性（P<0．01）；濃度梯度實驗結果，轉染siR

7、NA為50nM時，干擾效率最高。 3．轉染siRNA下調食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達后，細胞劃痕后24h后空白對照組和陰性對照組細胞劃痕明顯愈合，而siRNA轉染組幾乎沒有愈合；48h后空白對照組和陰性對照組已經(jīng)完全愈合，siRNA轉染組僅有少量愈合，與其它兩組比較差異顯著（P<0．01）；boyden chamber小室細胞侵襲實驗結果siRNA轉染組穿膜細胞數(shù)明顯減少，與空白對照組和陰性對照組比較，差異有顯著性

8、（P<0．05）。 4．干擾食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達后，基因芯片分析其表達譜的變化。結果發(fā)現(xiàn)330個探針表達明顯改變，對應有明確名稱的基因為235個，其中上調的127個，下調的108個；EST序列53個，其中上調17個，下調36個。共涉及87個信號通路，主要與細胞基質黏附、細胞遷移、細胞信號轉導、細胞周期、細胞凋亡以及衰老等相關。 結論：1．食管癌細胞表達MMP-2與其惡性程度和臨床病理改變相關，隨惡性

9、程度的升高其表達豐度升高；食管癌細胞KYSE150為MMP-2高表達細胞系，可作為進一步研究的實驗材料。 2．RNA干擾技術可高效地下調食管癌細胞KYSE150MMP-2基因的表達，可作為一種基因治療的策略深入研究。 3．食管癌細胞KYSE150MMP-2基因下調后，細胞遷移和侵襲能力顯著被抑制，表明MMP-2可作為食管癌基因治療的靶點。 4．食管癌細胞KYSE150MMP-2基因下調后，其細胞基因表達譜有明顯變