RNA干擾沉默Ki67基因影響腎癌細(xì)胞增殖和凋亡研究.pdf

1、目的:利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默Ki67基因的表達(dá)，研究其對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞增殖和凋亡影響，為RNAi用于腎癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1．Ki67 shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計(jì)、合成按siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)Ki67基因cDNA 364～384位置堿基序列的siRNA。再根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)總長度為63bp的shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA正、反義鏈二條。 2．shRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilen

2、cerKi67的構(gòu)建 將等量的將正、反義二條轉(zhuǎn)錄shRNA對(duì)應(yīng)模板的DNA序列，煺火處理后克隆至pSliencer。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMlO1感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I、HindIII將其切成二條片段，電泳觀察插入子及載體片段的分子量。重組質(zhì)粒命名為pSilencerKi67。 3．體外實(shí)驗(yàn)用LipofectamineTM2000將pSi lencerKi67轉(zhuǎn)染人腎癌786-0細(xì)胞，以空質(zhì)粒pSl

3、iencer及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,120h及144h收集樣本，采用RT-PCR檢測(cè)Ki67mRNA表達(dá)、Western blOt和免疫組化檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá)、MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖、TNUEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。 4．體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 取786-O細(xì)胞接種于雌性、4～6周齡BALB／C／nu裸鼠背部皮下組織內(nèi)。當(dāng)腫瘤生長至直徑10mm時(shí)隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組(A)、空質(zhì)粒組(B)、DSilenc

4、erKi67組(C)。將pSilencerKi67(20μg／K)每隔2天瘤內(nèi)注射，共7次。然后處死全部動(dòng)物，取腫瘤組織行免疫組化染色檢測(cè)Ki67的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 （1）.限制性酶切及測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒pSi lencerKi67構(gòu)建成功。 （2）．轉(zhuǎn)染pSilencer Ki67后24h、48h、72h、120h及144h，786-0細(xì)胞Ki67mRNA表達(dá)水平(41.7±1.5、34.1±1.7、54.5

5、±3.7、71.1±2.5、81.6±2.6)％均顯著低于空質(zhì)粒pSliencer、未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(97.7±0.9，100)％；經(jīng)蛋白印跡檢測(cè)786-0細(xì)胞Ki67蛋白水平為(47.3±1.6、42.6±1.6、59.6±2.7、75.6±1.6、78.7±2.1)％均顯著低于兩對(duì)照組(97.3±1.6，100)％；786-0細(xì)胞的相對(duì)抑制率分別為(62.3±4.5、76.74±3.2、73.3±6.4、53.2±5.2、49.2±2.

6、7)％均顯著低于兩對(duì)照組(70.1±5、0)％；786-0細(xì)胞的凋亡率分別為(18.7±4.5、38.3±3.0、74.3±5、23.5±3.7、19.1±2.5)％均顯著低于兩對(duì)照組(8.4±1.1，7.2±1.3)％。實(shí)驗(yàn)證實(shí)pSilencerKi67比對(duì)照組顯著抑制786-0細(xì)胞Ki67mRNA、Ki67蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(P<0.01)。 （3）.免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá)，A組陽性率平均為(33±