miR-203調(diào)控食管癌干細(xì)胞自我更新及食管癌相關(guān)甚因ECRG1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、食管癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界上位居惡性腫瘤的第七位,死亡率位于第六位。中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū),診斷的食管癌中90％以上是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。本研究分為兩部分:一,探討了miR-203如何調(diào)控對(duì)食管癌腫瘤干細(xì)胞自我更新:二,研究食管癌相關(guān)基因ECRG1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　 近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞成為了腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

2、在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,腫瘤干細(xì)胞可以自我更新,維持腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤干細(xì)胞的耐藥性強(qiáng),對(duì)放化療不敏感。正是由于腫瘤干細(xì)胞的存在,導(dǎo)致腫瘤病人術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)在于其自我更新和多向分化的潛能,因此,探究腫瘤干細(xì)胞的自我更新,無(wú)限增殖和多向分化的分子調(diào)控機(jī)制是十分重要的。
　　 現(xiàn)今在白血病,乳腺癌,腦瘤,前列腺癌,胰腺癌,肝癌中,通過(guò)細(xì)胞表面分子標(biāo)記的篩選,都已經(jīng)分離出腫瘤干細(xì)胞。并且驗(yàn)證了只有腫瘤干細(xì)胞有

3、自我增殖的能力并形成新的腫瘤這一特點(diǎn)。除此之外,側(cè)群細(xì)胞(side population cells,SP細(xì)胞)分選也是目前常用的分離和富集腫瘤干細(xì)胞的方法之一,已經(jīng)有多種腫瘤細(xì)胞系分離出了SP細(xì)胞,這些細(xì)胞也同樣具有腫瘤干細(xì)胞樣特性,具有自我更新和增殖的能力。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí),在食管癌細(xì)胞系中分選出的SP細(xì)胞能夠富集腫瘤干細(xì)胞,并且具有腫瘤干細(xì)胞樣特性,為本實(shí)驗(yàn)研究打下良好的基礎(chǔ)。
　　 miRNA(microRNA

4、)是最近新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,可以在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌或者促癌基因的作用。隨著研究的深入,現(xiàn)在研究者逐漸開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向miRNA調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的研究。miRNA-203是一個(gè)首先在皮膚細(xì)胞中鑒定出來(lái)的小分子,但隨后人們發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中,miRNA-203的表達(dá)量明顯下降,顯著區(qū)別與食管正常組織,說(shuō)明miRNA-203在食管癌變過(guò)程中起著重要的作用。
　　 本研究通過(guò)SP細(xì)胞分選,得到了富集

5、腫瘤干細(xì)胞的亞群SP細(xì)胞,miR-203在SP亞群的表達(dá)顯著低于NSP(none-SP cells)細(xì)胞亞群,而干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因Bmi-1表達(dá)與miR-203相反。我們通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系EC9706的方法,得到了穩(wěn)定高表達(dá)mir-203的細(xì)胞株Lenti-miR-203。我們通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bmi-1可能是miR-203的下游的靶基因。通過(guò)Western Blot驗(yàn)證,與對(duì)照相比Bmi-1在Lenti-miR-203細(xì)胞株中表

6、達(dá)明顯下降；在EC9706細(xì)胞中轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-203后,也得到相似的結(jié)果；在雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中,將構(gòu)建的Bmi-1的3’UTR熒光報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Lenti-miR-203細(xì)胞株中后,熒光活性顯著下降,而將構(gòu)建的Bmi-1的3’UTR結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,熒光活性得到一定的恢復(fù)。以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-203通過(guò)Bmi-1的3’UTR來(lái)調(diào)控:Bmi-1的表達(dá),Bmi-1確實(shí)是miR-203的一個(gè)靶基因。
　　 Bm

7、i-1是維持干細(xì)胞自我更新能力的重要基因。在腫瘤干細(xì)胞SP向NSP細(xì)胞分化的過(guò)程中,我們通過(guò)Western Blot檢測(cè)到Bmi-1在蛋白水平隨著分化程度的增高而表達(dá)量逐漸下降,說(shuō)明在腫瘤干細(xì)胞中,Bmi-1也起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,Lenti-miR-203細(xì)胞株體外成克隆能力顯著下降,對(duì)化療藥物的敏感性增加,裸鼠體內(nèi)的致瘤能力明顯減弱。將miR-203高表達(dá)細(xì)胞株做SP流式檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其SP細(xì)胞的比

8、例明顯下降。
　　 以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miR-203及其靶基因Bmi-1在腫瘤干細(xì)胞調(diào)控中起到重要作用,miR-203可能通過(guò)Bmi-1來(lái)調(diào)控食管癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新。miR-203能夠在內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新,為食管癌的治療提供新的策略和理論依據(jù)。
　　 食管癌相關(guān)基因1(Esophageal Cancer Related Gene1,ECRG1)是我實(shí)驗(yàn)室克隆出的新的食管癌相關(guān)基因。以往的研究結(jié)

9、果表明,ECRG1在體內(nèi)外可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),在食管癌組織中低表達(dá),提示它可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 為了探討ECRG1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,我們用5’端缺失突變法對(duì)ECRG1的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析,并確定了-463～+167bp是其核心啟動(dòng)子區(qū)域。我們?cè)贓CRG1的核心啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)兩個(gè)TGF-β通路下游信號(hào)分子Smad蛋白轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Smad5蛋白可以在體內(nèi)外與ECRG1的

10、核心啟動(dòng)子結(jié)合。Realtime PCR實(shí)驗(yàn)證明TGF-β處理可以上調(diào)ECRG1的表達(dá)。在EC9706細(xì)胞中,敲降Smad5蛋白水平,我們發(fā)現(xiàn),在隨后的TGF-β處理實(shí)驗(yàn)中,隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加,和對(duì)照組一樣,兩組細(xì)胞的ECRG1表達(dá)都逐漸增強(qiáng),但Smad5敲降組的ECRG1表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著下降。
　　 從以上的結(jié)果,我們得出結(jié)論,TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以通過(guò)下游蛋白Smad5與ECRG1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相互作用,從