Fascin 1基因在食管癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、食管癌是常見的惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制至今不甚明了。有研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與食管癌的發(fā)病有關(guān),但究竟起何作用并不清楚。為此,本研究聯(lián)合運(yùn)用雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、RT-PCR、免疫印跡、反義核酸、裸鼠成瘤等技術(shù)手段對(duì)HPV18E6E7基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的永生化食管上皮細(xì)胞SHEE及食管癌細(xì)胞SHEEmt之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定,并初步研究了基因的功能,以期為揭示HPV在食管癌發(fā)病中的作用提供新線索

2、。內(nèi)容與方法:
　　1、提取SHEE和SHEEmt細(xì)胞的總蛋白,雙向凝膠電泳分離,考馬斯亮藍(lán)染色,PDQuest(version6.2)軟件分析雙向凝膠電泳圖確定差異表達(dá)蛋白,進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定。
　　2、通過(guò)RT-PCR確定差異表達(dá)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平,并通過(guò)cDNA克隆和DNA測(cè)序等給予進(jìn)一步確認(rèn)。
　　3、通過(guò)免疫印跡對(duì)SHEE和SHEEmt細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證;通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)差異表達(dá)蛋

3、白在臨床食管鱗癌、腺癌和正常食管上皮組織中的表達(dá)情況。
　　4、在轉(zhuǎn)錄水平反義封閉SHEEmt和HeLa細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白基因的表達(dá),觀察細(xì)胞生物學(xué)特性的變化規(guī)律,初步確定差異表達(dá)蛋白的功能。
　　結(jié)果:
　　1、雙向凝膠電泳和MALDI-TOF-MS發(fā)現(xiàn),與SHEE中的比較,fascin1和磷酸丙糖異構(gòu)酶在SHEEmt中在蛋白質(zhì)翻譯層面上表現(xiàn)上調(diào)。
　　2、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與SHEE中的比較,SHEEmt

4、中fascin1和磷酸丙糖異構(gòu)酶在mRNA轉(zhuǎn)錄層面上均表現(xiàn)上調(diào),但相比之下fascin1mRNA的上調(diào)更明顯。測(cè)序結(jié)果顯示,所擴(kuò)增的fascin1基因片段的序列與GenBank上的fascin1基因一致。
　　3、免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,與SHEE中的比較,fascin1蛋白在SHEEmt細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯增高;免疫組織化學(xué)檢測(cè)fascin1在食管鱗癌和腺癌組織表達(dá)呈陽(yáng)性,在正常食管上皮組織表達(dá)呈陰性,且部分正常食管上皮組織增殖旺

5、盛的基底細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性。
　　4、構(gòu)建了fascin1基因編碼區(qū)部分片段的反義表達(dá)載體pcDNA3.0-fascin(-),并成功轉(zhuǎn)染SHEEmt和HeLa細(xì)胞。
　　5、在HeLa細(xì)胞中,反義封閉fascin1基因后,細(xì)胞的絲狀偽足和微棘減少,表現(xiàn)為聚集生長(zhǎng)。檢測(cè)結(jié)果表明,fascin1基因在轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為明顯下調(diào),但在蛋白翻譯水平相應(yīng)性下調(diào)表現(xiàn)不明顯。
　　6、反義封閉fascin1基因表達(dá)對(duì)SHEEmt和HeLa

6、細(xì)胞的生長(zhǎng)周期未見明顯影響,SHEEmt-fascin(-)和HeLa-fascin(-)細(xì)胞仍可在SCID小鼠成瘤。
　　結(jié)論:
　　1、與SHEE中的比較,fascin1基因和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因在SHEEmt中在蛋白質(zhì)翻譯層面上均表達(dá)增高。提示fascin1和磷酸丙糖異構(gòu)酶可能與SHEE細(xì)胞的惡性變相關(guān)。
　　2、與SHEE中的比較,fascin1和磷酸丙糖異構(gòu)酶在SHEEmt中在mRNA轉(zhuǎn)錄層面上均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá),