全基因組范圍內TCF7L2-TCF4結合位點確定及其轉錄調控miR-21的機制研究.pdf

1、膠質瘤是由神經外胚層分化而來的膠質細胞發(fā)生的腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱內腫瘤。中國顱內腫瘤的平均年發(fā)病率為10/10萬，其中膠質瘤占40％-67％。由于膠質瘤呈浸潤性無限制增生，與正常腦組織無明顯界限，而且富于血管，手術很難完全切除。運用現代顯微外科技術、放療、化療等綜合治療措施后，膠質瘤患者預后仍不理想。該情況在近30年的臨床實踐中未得到根本改善。因此膠質瘤仍是神經系統(tǒng)的難治性疾病，相關研究內容是神經系統(tǒng)的熱點課題。單純手術治療預后較差

2、，如今多采用手術治療輔助放療和化療的綜合治療的手段，但惡性膠質瘤的總體治療效果仍不盡如人意，因此尋找有效地治療手段勢在必行。近年來，由于分子生物學取得的突破性進展，目前許多研究表明，膠質瘤的惡性進展涉及信號轉導通路的異常，這為開辟新的治療手段提供了新思路，因此采取針對腫瘤細胞內傳導通路上的特異分子的生物靶向藥物治療癌癥已經成為新的發(fā)展趨勢。
　　Wnt/β-catenin信號途徑在胚胎發(fā)育過程以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用.

3、由于其在人類不同腫瘤中的廣泛激活，調節(jié)細胞的生長、遷移和分化，已被公認為腫瘤發(fā)生過程中關鍵的信號通路之一。近年來大量文獻報道了Wnt通路在惡性膠質瘤中異常激活，其重要作用因子beta-catenin的表達情況與病人的預后及生存質量關系密切。Wnt通路是一條十分保守的信號傳導通路.從低等生物果蠅直至高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性.Wnt信號通路不僅在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用而且在各種腫瘤中表現為異常激活狀態(tài)，也是現階段研究最深入

4、的分子通路，其在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了巨大的影響著包括惡性膠質瘤細胞增殖、侵襲、凋亡等各種惡性表型在內的生物學行為。
　　現已有大量研究證實，miRNA表達譜紊亂在癌癥發(fā)生過程中起著重要作用。在慢性淋巴細胞性白血病、乳腺癌、結腸癌、肺癌等等在內的許多其他器官系統(tǒng)腫瘤中均存在miRNA表達譜的紊亂。特異性的miRNA表達紊亂可以被認為是新的腫瘤分子標簽。目前研究證實miRNA的主要致癌機制是與編碼基因的3’端結合，mRNA3

5、’UTR的5’端有長度為6～8個堿基被稱為miRNA結合種子序列?，F在認為，miRNA調控基因表達的方式與miRNA和種子序列的互補程度有關。在哺乳動物、線蟲、果蠅中，大多數miRNA和種子序列不完全互補的方式結合發(fā)揮抑制mRNA翻譯成蛋白的作用。而在植物中，miRNA則是通過和種子序列完全互補進而介導mRNA降解的方式來調節(jié)靶基因的表達。由于在哺乳動物細胞里，miRNA的不完全互補作用方式決定了一個miRNA可以有多個作用靶基因；相應

6、地，某一個mRNA3’UTR種子序列也可以受眾多miRNA的調控作用。盡管目前miRNA在膠質瘤中的研究仍處于起步階段，但已有大量文獻報道在神經膠質瘤中表達水平異常的miRNA可能發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，為神經膠質瘤的診斷與治療提供了新的方向。
　　本課題從基因網絡分析和體內外實驗重點研究膠質瘤細胞中miR-21受β-catenin/TCF-4復合物的轉錄調控，為其直接靶點。本課題研究分以下三部分：
　　第一部分：T

7、CF4/TCF7L2通過與miRNAs啟動子區(qū)相結合而調控其轉錄。應用TCF4ChIP-ChIP分析6，868個TCF4結合峰值從中找出TCF4結合區(qū)周圍的miRNAs。ChIP-PCR檢測在LS174T、MSF-7和U87三個不同細胞系中TCF4與miRNAs的啟動子區(qū)相結合。
　　第二部分：阿司匹林通過阻斷Wnt信號通路而改變膠質瘤細胞的惡性表型的研究。TOP-FOP實驗檢測加入阿司匹林組后Wnt通路的活性，RT-PCR、We

8、steronBlot檢測Wnt信號通路下游靶點的變化。MTT實驗檢測阿司匹林處理后細胞增殖的變化；FCM實驗評價細胞周期的改變；AnnexinV實驗檢測阿司匹林組與對照組細胞凋亡率的變化；transewell實驗檢測膠質瘤細胞侵襲能力的改變。
　　第三部分：驗證TCF4/TCF7L2對miR-21的直接調控作用。應用各種體內外實驗westernblot、pcr、免疫組化及熒光素酶等證明miR-21是Wnt/β-catenin信號通