ATF6對XBP1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：確定XBP1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域及ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)(Endoplasmic reticulum stress，ERS)與非應(yīng)激狀態(tài)時(shí)對XBP1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。 方法：采用基因重組技術(shù)構(gòu)建ATF6基因和三個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失體ATF6S1P，ATF6S2P，ATF6SP的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-ATF6，pcDNA3.1(-)-S1P，pcDNA3.1(-)-S2P，pcDNA3.1(-)-SP；構(gòu)

2、建XBP1基因啟動(dòng)子報(bào)告載體pGL3-XBP1。針對XBP1啟動(dòng)子的各個(gè)組成元件，分別設(shè)計(jì)和構(gòu)建XBP1一系列截短體的報(bào)告載體。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測和確定XBP1啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)一步結(jié)合免疫印跡方法檢測ATF6及缺失體S2P、S1P、SP在ERS與非ERS狀態(tài)下對XBP1核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。根據(jù)XBP1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性設(shè)計(jì)一系列突變體，檢測每個(gè)突變型報(bào)告載體轉(zhuǎn)錄活性，在ERS與非ERS狀態(tài)下檢測ATF6及三個(gè)缺失體對

3、每個(gè)XBP1突變型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：XBP1啟動(dòng)子的-407bp～+133bp區(qū)域是轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的核心區(qū)域；XBP1啟動(dòng)子的-2000bp～-407bp區(qū)域不具有轉(zhuǎn)錄活性，提示XBP1啟動(dòng)子的-2000bp～407bp區(qū)域可能含有抑制轉(zhuǎn)錄活性的組成元件。非ERS狀態(tài)時(shí)，ATF6及兩個(gè)缺失體S2P、SIP對XBP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于陰性對照，同時(shí)免疫印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ATF6及兩個(gè)缺失體S2P、S1P后XBP1蛋白表

4、達(dá)也明顯升高；而在ERS狀態(tài)時(shí)，ATF6及兩個(gè)缺失體S2P、S1P對XBP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ATF6及兩個(gè)缺失體S2P、S1P后XBP1蛋白表達(dá)也相應(yīng)減少。突變IRE CS、SP(-1879)結(jié)合位點(diǎn)，XBP1轉(zhuǎn)錄活性明顯增加；在應(yīng)激與非應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，突變IRE CS、SP(-1879)、SP(-690)結(jié)合位點(diǎn)，ATF6上調(diào)XBP1轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論：ATF6調(diào)控XBP1的轉(zhuǎn)錄在ER