調(diào)控Smad核轉(zhuǎn)錄共抑制因子（SnoN）的分子機(jī)制與腎纖維化關(guān)系的研究.pdf

1、Smad核轉(zhuǎn)錄共抑制因子(SnoN)作為一種拮抗劑可嚴(yán)格調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/smad(TGF-β1/Smad)信號(hào)的活性，從而保證在正常的生理?xiàng)l件下TGF-β1/smad信號(hào)輸出的穩(wěn)定性。既往的研究表明在單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)(UUO)后所致的纖維性腎病中SnoN蛋白表達(dá)進(jìn)行性下降；而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)則可通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)SnoN從而拮抗TGF-β1的致纖維化作用。但是目前引起SnoN表達(dá)變化的調(diào)控機(jī)制不明。因此本研

2、究探討了在梗阻性腎病中snoN表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制以及HGF引起細(xì)胞特異性SnoN表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子-2(Smurf2)是一種E3泛素鏈接酶，可通過(guò)選擇性介導(dǎo)Smad信號(hào)途徑中關(guān)鍵組分的降解從而在TGF-β信號(hào)活性的調(diào)節(jié)中起樞紐作用。由于TGF-β信號(hào)活性亢進(jìn)在纖維性腎病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，因此，在本研究中我們還探討了Smurf2在纖維性腎病中表達(dá)的調(diào)節(jié)、其靶蛋白的特異性以及其表達(dá)上調(diào)的生物學(xué)意義。

3、方法： (1)采用結(jié)扎雄性CD-1小鼠左側(cè)輸尿管的方法建立UUO動(dòng)物模型，并設(shè)假手術(shù)小鼠為正常對(duì)照組。應(yīng)用蛋白印跡、Northern印跡和ⅣF-PCR技術(shù)，檢測(cè)腎組織中SnoN mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；并借助蛋白降解和泛素化活性的體外檢測(cè)方法，觀察在梗阻性腎病中SnoN蛋白降解率和泛素化活性的變化；并采用免疫組織化學(xué)和免疫沉淀技術(shù)觀察Smurf2的表達(dá)以及與SnoN之間的相互作用，初步探討在梗阻性腎病中SnoN表達(dá)變化的分

4、子機(jī)制； (2)在人的近曲小管上皮細(xì)胞(HKC)中，運(yùn)用蛋白印跡、RT-PCR、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫熒光和RNA干擾等技術(shù)進(jìn)一步探討了TGF-β1引起SnoN表達(dá)水平變化的分子機(jī)制以及SnoN對(duì)TGF-β1致纖維化反應(yīng)的影響作用； (3)采用HKC細(xì)胞為體外觀察系統(tǒng)，應(yīng)用各種特異的化學(xué)抑制劑，通過(guò)蛋白印跡、RT-PCR等方法探討HGF誘導(dǎo)SnoN表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；進(jìn)一步應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù)從基因水平觀

5、察HGF誘導(dǎo)SnoN表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制； (4)采用UUO的方法建立腎小管-間質(zhì)病變動(dòng)物模型，并給予外源性HGF處理，通過(guò)蛋白印跡、免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色方法從體內(nèi)進(jìn)一步探討HGF誘導(dǎo)SnoN表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制； (5)采用各種原因所致腎病患者的腎活檢組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)在纖維性腎病中Smurf2表達(dá)水平的變化； (6)在HKc細(xì)胞中，利用RT-PCR、蛋白印跡等方法探討了TGF-β1對(duì)于

6、Smurf2表達(dá)的影響及其作用機(jī)制； (7)采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和蛋白印跡分析技術(shù)，進(jìn)一步探討了Smurf2對(duì)于RGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各組分表達(dá)的影響；同時(shí)以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測(cè)和蛋白印跡分析等技術(shù)觀察過(guò)度表達(dá)Smurf2對(duì)于TGF-β1誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和纖維化反應(yīng)的影響。 結(jié)果： (1)與假手術(shù)組相比，UUO術(shù)后7天小鼠腎組織中SnoN蛋白表達(dá)水平明顯降低而其mRNA水平保持相對(duì)穩(wěn)定，并且SnoN的

7、泛素化活性和蛋白酶體依賴性的蛋白降解率明顯增加；此外，在梗阻性腎病中Smurf2表達(dá)增加，并與SnoN形成復(fù)合物。 (2)在HKC細(xì)胞中，TGF-β1可誘導(dǎo)SnoN蛋白經(jīng)泛素-蛋白酶體依賴性途徑降解；盡管SnoN可與另一個(gè)Smad轉(zhuǎn)錄共抑制因子Ski形成復(fù)合物，且在TGF-β1刺激下，它們可分別與Smad2/3形成三元絡(luò)合物，但異位表達(dá)Ski并不能影響SnoN的降解率；而且以蛋白酶體抑制劑阻斷SnoN的降解或采用RNA干擾技術(shù)下

8、調(diào)Smurf2的表達(dá)來(lái)增加SnoN蛋白表達(dá)水平可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和纖維結(jié)合素的表達(dá)，提示SnoN的降解是TGF-β1施加其致纖維化反應(yīng)的必要條件。 (3)在HKC細(xì)胞中，HGF誘導(dǎo)的SnoN表達(dá)上調(diào)發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平，且是由Erk-1/2信號(hào)途徑介導(dǎo)的；HGF可快速激活Erk-1/2信號(hào)途徑上、下游的信號(hào)分子，然后引起核內(nèi)cAMP反應(yīng)元件(CRE)結(jié)合蛋白(CREB)的活化；染色質(zhì)免疫沉淀分析結(jié)

9、果顯示，HGF可促使CREB和Spl結(jié)合到其在SnoN基因啟動(dòng)子區(qū)中的相關(guān)位點(diǎn)上；此外，蛋白印跡分析結(jié)果表明HGF僅在HKC細(xì)胞中誘導(dǎo)CREB的活化，而在系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中無(wú)此作用；而且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和特異性化學(xué)抑制劑作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明CREB的活性和Spl是啟動(dòng)HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞特異性SnoN表達(dá)上調(diào)的必要因素。 (4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：在梗阻性腎病中，給予外源性的HGF基因可誘導(dǎo)腎組織內(nèi)Erk-1/2的磷酸化、CREB的活化

10、以及SnoN表達(dá)上調(diào)。 (5)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在各種原因所致腎病患者的腎小管中Smurf2表達(dá)明顯增加；而在HKC細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)SnoN抑制Smad信號(hào)活性可完全阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的Smurf2表達(dá)上調(diào)。 (6)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在基礎(chǔ)狀態(tài)下，過(guò)度表達(dá)Smurf2可促進(jìn)Smad2及其核轉(zhuǎn)錄共抑制因子——SnoN、Ski和TGIF蛋白表達(dá)下調(diào)，這主要是通過(guò)蛋白酶體依賴性蛋白降解的增強(qiáng)而引起的；熒光素酶活性檢測(cè)

11、等結(jié)果也證實(shí)了過(guò)度表達(dá)Smurf2可增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄、E-上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)及纖維結(jié)合素表達(dá)上調(diào)。 (7)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果表明過(guò)度表達(dá)Smad2和Smad3可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的纖維結(jié)合素表達(dá)上調(diào)；反之，用siRNA技術(shù)抑制Smad2和Smad3的表達(dá)可阻斷TFG-β1所致的纖維結(jié)合素表達(dá)上調(diào)。因此，提示在腎小管上皮細(xì)胞中Smad2和Smad3是TGF-β1誘導(dǎo)的纖維結(jié)合素表達(dá)上調(diào)的必要條件。 結(jié)論：

12、 (1)在梗阻性腎病中，SnoN表達(dá)水平的下調(diào)主要是通過(guò)泛素一蛋白酶體依賴性蛋白降解的增強(qiáng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 (2)CREB活化和Spl一起觸發(fā)HGF誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞特異性SnoN表達(dá)上調(diào)。 (3)雖然在纖維性腎病腎小管中Smurf2表達(dá)特異性上調(diào)，而且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明TGF-β1可通過(guò)Smad信號(hào)途徑介導(dǎo)Smurf2表達(dá)上調(diào)，但由于在腎小管上皮細(xì)胞中Smurf2既可引起TGF-β1/Smad信號(hào)陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子的降解，