α酮酸加低蛋白飲食抑制腎纖維化的作用及其機(jī)制.pdf

1、慢性腎臟病(CKD)是一種常見腎臟疾病，若未能進(jìn)行有效治療，最終將進(jìn)入終末期腎臟病(ESRD)。腎纖維化是各種病因?qū)е碌腃KD發(fā)展至ESRD階段的共同途徑和主要病理結(jié)果。氧化應(yīng)激、慢性炎癥及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等細(xì)胞因子均在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Kruppel樣因子15(KLF15)是一種在體內(nèi)廣泛分布的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白家族，通過對(duì)多種基因的表達(dá)調(diào)控參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程。20

2、07年Fisch S等研究表明，KLF15參與調(diào)控心臟纖維化的發(fā)生，其機(jī)制與抑制Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)錄和結(jié)締組織生長因子(CTGF)啟動(dòng)子活性有關(guān)。腎纖維化的發(fā)生與心臟纖維化存在相似機(jī)制，但目前尚無KLF15與腎臟纖維化關(guān)系的研究，其是否是影響CKD腎纖維化發(fā)生及進(jìn)展的重要因素是本研究的關(guān)注方向。
　　 限制蛋白飲食是CKD的主要治療策略之一，可減輕CKD患者氮質(zhì)血癥，延緩腎衰病情進(jìn)展，但單純低蛋白血癥可能會(huì)引起營養(yǎng)不良等問題。目前臨床常

3、采用低蛋白加α酮酸治療CKD患者，α酮酸可提供必需氨基酸并減少氨基氮的攝入，在不增加體內(nèi)毒素的同時(shí)維持一個(gè)相對(duì)良好的營養(yǎng)狀態(tài)。但目前仍不清楚低蛋白加α酮酸飲食在延緩CKD病程進(jìn)展中的作用是否要優(yōu)于單純低蛋白飲食及其具體機(jī)制。考慮到氧化應(yīng)激、炎癥在CKD腎纖維化中的作用，本研究的目的在于：明確α酮酸加低蛋白飲食是否較單純低蛋白飲食可更好地延緩CKD大鼠腎損害進(jìn)展，減輕氧化應(yīng)激、和炎癥在其中的作用，此外，我們還將進(jìn)一步探討KLF15在腎纖維

4、化進(jìn)展中的作用和機(jī)制。
　　 為此，我們首先建立5/6腎切除SD大鼠CKD模型，對(duì)照組大鼠行假手術(shù)(Control，n=12)，手術(shù)組大鼠分別給予正常蛋白飲食(NPD，n=15)、低蛋白飲食(LPD，n=15)和低蛋白飲食加α-酮酸(LPD+KA，n=15)，干預(yù)6個(gè)月留取血、尿標(biāo)本后處死大鼠，進(jìn)行血、尿生化檢測(cè)；留取腎組織包埋切片，進(jìn)行Masson染色、電鏡、Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)；提取腎組織總RNA，進(jìn)行Re

5、al-time PCR檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，血尿素氮、尿蛋白、Masson染色病理評(píng)分、電鏡、膠原染色和纖維化相關(guān)的Real-time PCR均顯示：與對(duì)照組相比，NPD組出現(xiàn)明顯的腎功能惡化，LPD較NPD可改善病情進(jìn)展，而LPD+KA對(duì)腎功能的保護(hù)作用較LPD更明顯(P＜0.05)。LPD組出現(xiàn)低體重、低血清白蛋白等營養(yǎng)不良的表現(xiàn)，而LPD+KA組未出現(xiàn)明顯的營養(yǎng)不良(P＜0.

6、05)。由于已有研究證實(shí)，蛋白營養(yǎng)不良可致組織氧化應(yīng)激和炎癥水平的增加，而氧化應(yīng)激和炎癥是CKD腎纖維化的發(fā)生和進(jìn)展的重要因素，因此，低蛋白加α酮酸飲食較單純低蛋白飲食更好地減緩腎損害進(jìn)展，其作用可能與改善營養(yǎng)不良，減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激和炎癥在低蛋白加α酮酸飲食在延緩CKD病程進(jìn)展中的作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了各組的氧化應(yīng)激和炎癥的相關(guān)指標(biāo)。將上述大鼠腎組織行組織勻漿檢測(cè)SOD、MDA，提取總蛋白

7、行oxybolt檢測(cè)蛋白氧化水平，同時(shí)組織切片進(jìn)行硝基化酪氨酸和CD68免疫組織化學(xué)檢測(cè)。此外還提取腎組織總RNA，采用Real-time PCR檢測(cè)TNF-α、MCP-1、RANTES和CXCL-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，LPD組和LPD+KA組氧化應(yīng)激(MDA、硝基化酪氨酸、oxybolt)和炎癥(CD68、TNF-α、MCP-1、RANTES、CXCL-1)相關(guān)指標(biāo)較NPD組顯著改善，同時(shí)，LPD+KA組相關(guān)指標(biāo)也顯著好于LPD

8、組(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，低蛋白加α酮酸飲食通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而減緩CKD腎損害進(jìn)展。
　　 隨后，我們研究了KLF15在腎纖維化中的作用。首先通過對(duì)上述大鼠腎組織的免疫熒光和Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KLF15主要在對(duì)照組腎組織的系膜細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，5/6腎切除后表達(dá)顯著下降，予以低蛋白和低蛋白加α酮酸飲食可使其表達(dá)增加，且LPD+KA組較LPD組增加更為顯著(P＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)中我

9、們采用TGF-β1、TNF-α和H202干預(yù)大鼠系膜細(xì)胞(RMCs)，提取總RNA行Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干預(yù)后KLF15表達(dá)降低(P＜0.05)；同時(shí)通過對(duì)TNFR1-/-小鼠系膜細(xì)胞及NF-κB基因敲除的RelA-/-小鼠胚腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(MEF)進(jìn)行TNF-α干預(yù)，Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α通過TNF受體1和NF-κB途徑減少KLF15表達(dá)。為進(jìn)一步研究KLF15與纖維化的關(guān)系，我們將KLF15質(zhì)粒瞬

10、時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293)和RMCs細(xì)胞，提取總RNA行Real-time PCR和提取細(xì)胞蛋白及上清行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示過表達(dá)KLF15可顯著減少HEK293和RMCs細(xì)胞纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)(P＜0.05)。此部分結(jié)果表明KLF15參與調(diào)控腎纖維化進(jìn)程，飲食干預(yù)可通過影響KLF15表達(dá)而延緩CKD進(jìn)展。
　　 總之，本研究發(fā)現(xiàn)α酮酸加低蛋白飲食較單純低蛋白飲食可顯著地延緩CKD大鼠腎損害進(jìn)展，其作用與降低