低蛋白合并α-酮酸飲食在慢性腎臟病和維持性血液透析中的應(yīng)用及其機(jī)制探討.pdf

1、第一部分短期低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)維持性血液透析患者難治性高磷血癥的影響目的:高磷血癥是維持性血液透析患者常見并發(fā)癥之一,與患者心血管并發(fā)癥和腎性骨病的發(fā)生密切相關(guān),然而臨床上治療卻很棘手,血磷控制達(dá)標(biāo)率很低。限制蛋白質(zhì)攝入必然會(huì)減少磷的攝入,但是出于對(duì)營(yíng)養(yǎng)狀況的擔(dān)憂,臨床上缺乏在血液透析患者中應(yīng)用低蛋白飲食的經(jīng)驗(yàn)。開同?是復(fù)方α-酮酸制劑,合并低蛋白飲食應(yīng)用,能補(bǔ)充慢性腎臟病患者體內(nèi)缺乏的必需氨基酸,維持正氮平衡;由于含鈣,還能在一

2、定程度上結(jié)合磷。因此,本研究旨在觀察短期低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)維持性血液透析患者難治性高磷血癥的影響。方法:在專業(yè)營(yíng)養(yǎng)師的指導(dǎo)下按照患者體重指數(shù)(BMI)及飲食習(xí)慣制定個(gè)體化的低蛋白食譜,熱卡為30-35kcal/kg/d,蛋白質(zhì)攝入為0.8g/kg/d,同時(shí)予以復(fù)方α-酮酸制劑12片/天口服,治療8周。通過3日飲食日記、營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)分、人體測(cè)量學(xué)指標(biāo)(上臂肌圍、肱三頭肌皮褶厚度、干體重、體重指數(shù)等)和生化指標(biāo)(血清肌酐、校正的蛋白質(zhì)分

3、解率、血清總蛋白、血清白蛋白、血漿氨基酸譜)對(duì)患者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)估。測(cè)定治療前后的高敏C反應(yīng)蛋白(hs CRP)、尿素清除率(Kt/V)和CO2結(jié)合力(CO2-CP),分別觀察患者的炎癥狀態(tài)、透析充分性和代謝性酸中毒情況。測(cè)定治療前后的血鈣、磷(計(jì)算鈣磷乘積)和全段甲狀旁腺激素(iPTH)的水平,評(píng)價(jià)該療法對(duì)鈣磷代謝,營(yíng)養(yǎng)狀況等的影響。結(jié)果:所有患者平均攝入的總熱卡為:30.10±3.70kcal/kg/d,蛋白質(zhì)為:0.86±0.15

4、g/kg/d,磷為:669.55±134.51mg/d。營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)分、人體測(cè)量學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)在試驗(yàn)前后的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05)。hs CRP和Kt/V水平在治療前后的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05),CO2-CP水平在試驗(yàn)后顯著升高[(25.34±2.81vs18.49±1.77)mmol/L,p<0.001]。血磷及鈣磷乘積水平在試驗(yàn)后較試驗(yàn)前顯著下降[P:(5.59±1.20 vs7.26±1.42)mg/d

5、l,p<0.001;Ca×P:(52.94±12.80 Vs70.60±12.39)mg2/dl2,p<0.001]。血Ca和iPTH水平在治療前后的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Ca:(9.44±1.04 vs9.80±1.00)mg/dl;iPTH:(454.23±36.51 vs531.28±48.00)pg/ml](p值均>0.05)。結(jié)論:短期低蛋白飲食合并α-酮酸療法是一種安全有效治療維持性血液透析患者難治性高磷血癥的方法。長(zhǎng)期使用該

6、方法的療效和安全性有待于更多大規(guī)模、多中心、隨機(jī)對(duì)照的臨床研究加以證實(shí)。第二部分低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)腎臟保護(hù)作用機(jī)制的動(dòng)物研究(一)低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)5/6腎大部切除大鼠的腎臟保護(hù)作用和機(jī)制探討目的:低蛋白合并α-酮酸飲食的營(yíng)養(yǎng)療法在臨床上常用于中重度腎功能損害的慢性腎臟病患者以延緩病程進(jìn)展,但是目前對(duì)其治療安全性的認(rèn)識(shí)仍存在爭(zhēng)議,而且其腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制也不清楚。因此本研究旨在觀察低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)5/6腎大部切除

7、大鼠腎功能的影響,并探討相關(guān)可能的機(jī)制。方法:30只雄性SD大鼠行5/6腎大部切除術(shù)建立慢性腎功能衰竭模型,1周后給予不同蛋白含量飼料喂養(yǎng),根據(jù)喂養(yǎng)分組如下:(1)正常蛋白組(NPD組):予18％酪蛋白;(2)低蛋白組(LPD組):予6%酪蛋白;(3)低蛋白+α-酮酸組(LK組):予5%酪蛋白+1%α-酮酸,每組10只大鼠。另取10只雄性SD大鼠行假手術(shù)后予以正常蛋白(18%酪蛋白)含量飼料作對(duì)照組(Sham組)。12周后麻醉處死大鼠,

8、留取血、尿和腎臟組織標(biāo)本。常規(guī)生化法檢測(cè)血清白蛋白(Alb)、總蛋白(TP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和空腹血糖(FBG);放免法檢測(cè)大鼠空腹血清胰島素;考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定24h尿蛋白排泄量(24UPro);掃描電鏡觀察腎小球?yàn)V過膜的超微結(jié)構(gòu)。蛋白組學(xué)法檢測(cè)血清中差異蛋白質(zhì)的表達(dá);比色法測(cè)定血清中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)

9、和谷胱甘肽髓過氧化物酶(GSH-Px)的水平。免疫組織化學(xué)和免疫印跡法檢測(cè)腎臟中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)的表達(dá)。糖原染色法(PAS)觀察腎小球硬化指數(shù)(GSI)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增生病變。結(jié)果:1.一般情況:建模3個(gè)月后4組大鼠的體重、血清白蛋白和血清總蛋白水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05)。NPD、LPD、LK組大鼠的Scr較Sham組顯著升高[(NPD:58.67±4.80 vs.LPD:59.40±3.65vs.

10、LK:58.60±4.56vs.Sham:34.67±5.47)umol/L](p值均<0.05),但前3組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05);LPD組(7.26±1.29)和LK組大鼠(6.63±2.20)的BUN水平較NPD組(11.03±2.45)顯著降低(p值均<0.05)。NPD、LPD、LK組大鼠的24UPro水平也較Sham組明顯增多(p值均<0.05),但其中LK組24UPro水平較NPD組和LPD組顯著降低[(

11、NPD:94.23±20.15 vs LPD:58.70±8.18vs LK:38.30±5.50 vs Sham:17.70±8.10)mg/24h](p值均<0.05)。NPD組大鼠的腎小球?yàn)V過膜存在輕度足突融合和內(nèi)皮細(xì)胞屏障結(jié)構(gòu)紊亂,而LPD組和LK組大鼠的腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)基本正常。2.應(yīng)用蛋白組學(xué)分析了4組大鼠血清中共328種蛋白質(zhì)。NPD、LPD和LK組與Sham組相比:5種蛋白質(zhì)表達(dá)增高,8種蛋白質(zhì)(如:抗氧化作用的谷胱甘肽

12、過氧化物酶GSH-Px等)表達(dá)降低;LPD組與NPD組相比:5種蛋白質(zhì)(如:抗氧化酶GSH-Px等)表達(dá)增高,10種蛋白質(zhì)(如:急性反應(yīng)期蛋白:胰蛋白酶抑制劑重鏈4-ITIH4等)表達(dá)降低;LK組和NPD組相比:14種蛋白質(zhì)(如:營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)鐵蛋白serotransferrin和抗氧化酶GSH-Px等)表達(dá)增高,7種蛋白質(zhì)(如ITIH4和載脂蛋白ApoE等)表達(dá)降低;LK組和LPD組相比:9種蛋白質(zhì)(如:抗氧化酶GSH-Px等)表達(dá)增高

13、,6種蛋白質(zhì)(如:載脂蛋白ApoE和纖維化相關(guān)的層粘連蛋白laminin)表達(dá)降低。3.糖脂代謝:FBG在4組大鼠間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05),但NPD、LPD和LK組大鼠的空腹血清胰島素(NeD:41.86±6.13;LPD:27.49±4.15;LK:18.71±3.92)、HOMA-IR(NPD:19.93±1.52;LPD:14.68±0.10;LK:10.23±2.02)均較Sham組[Insulin:(12.4

14、8±2.24);HOMA-IR:(4.51±0.61)]顯著升高(p值均<0.05),而在LK組中兩項(xiàng)指標(biāo)均較LPD組和NPD組顯著降低(p值均<0.05)。HDL在4組大鼠間的差異亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05),但NPD、LPD和LK組大鼠的TG:(NPD:1.25±0.46;LPD:1.20±0.36;LK:0.92±0.33)、CHO:(NPD:2.89±0.65;LPD:2.56±0.51;LK:2.47±0.52)和LD

15、L:(NPD:0.33±0.12;LPD:0.28±0.10;LK:0.25±0.08)水平均較Sham組[TG:(0.71±0.16);CHO:(1.53±0.11);LDL:(0.16±0.03)]顯著升高(p值均<0.05),而僅僅CHO和TG水平在LK組中較NPD組中顯著降低(p值均<0.05)。4.循環(huán)中氧化應(yīng)激:NPD、LPD和LK組大鼠的血清中MDA含量均顯著高于Sham組(3.1992±0.1781)(p值均<0.05)

16、,但其中LK組(4.6056±0.1217)和LPD組(5.2752±0.1572)血清中MDA含量均較NPD組(6.4898±0.2621)顯著減少,LK組血清中MDA含量又較LPD組進(jìn)一步減少(p值均<0.05);而NPD、LPD和LK組大鼠的血清中SOD和GSH-Px水平均顯著低于Sham組[SOD:(46.5054±2.4142);GSH-Px:(332.2500±33.8189)](p值均<0.05),但其在LK組[SOD:(

17、28.0876±1.0904);GSH-Px:(173.7770±4.0926)]和LPD組[SOD:(22.4170±1.2948);GSH-Px:(117.5703±5.4685)]血清中的水平均較NPD組[SOD:(15.2142±1.9010);GSH-Px:(63.0785±4.8479)]顯著升高,在LK組血清中的水平又較LPD組進(jìn)一步升高(p值均<0.05)。5.腎臟纖維化:纖維化因子TGF-β1蛋白在NPD組中的表達(dá)(0

18、.6459±0.0442)顯著高于在LPD組(0.3763±0.0314)和LK組(0.3128±0.0296)中的表達(dá)(p值均<0.05)。NPD、LPD和LK組大鼠的腎小球硬化指數(shù)(GSI)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增生評(píng)分均較Sham組顯著增高(p值均<0.05),但在LK組和LPD組中均較NPD組顯著降低[GSI:(NPD:37.50±6.31vs LPD:18.32±3.22 vs LK:14.91±2.33 vs Sham:2.

19、71±1.02);ECM增生評(píng)分:(NPD:0.176±0.05 vs LPD:0.078±0.02 vs LK:0.056±0.02 vs Sham:0.032±0.01);p值均<0.05]。結(jié)論:低蛋白合并α-酮酸飲食能在保證5/6腎大部切除大鼠穩(wěn)定營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的同時(shí),改善血脂代謝紊亂和胰島素抵抗,并具有減輕5/6腎大部切除大鼠氮質(zhì)血癥、減少足突融合、降低蛋白尿排泄等腎臟保護(hù)作用,可能與改善腎臟纖維化病變和減輕循環(huán)中增強(qiáng)的氧化應(yīng)激有關(guān)

20、。(二)低蛋白合并α-酮酸飲食對(duì)5/6腎大部切除大鼠腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響目的:腎臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活,能導(dǎo)致腎臟局部氧化應(yīng)激增強(qiáng)和腎臟纖維化病變加重,是慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一。已有研究證實(shí)高蛋白飲食會(huì)導(dǎo)致腎臟局部腎素產(chǎn)生增多,因此本研究旨在觀察低蛋白合并α-酮酸飲食能否通過影響5/6腎大部切除大鼠腎素-血管緊張素系統(tǒng)的興奮性而產(chǎn)生腎臟保護(hù)作用。方法:30只雄性SD大鼠行5/6腎大部切除術(shù)建立慢性腎功能衰竭模型,1

21、周后給予不同蛋白含量飼料喂養(yǎng),根據(jù)喂養(yǎng)分組如下:(1)正常蛋白組(NPD組):予18%酪蛋白;(2)低蛋白組(LPD組):予6%酪蛋白;(3)低蛋白+α-酮酸組(LK組):予5%酪蛋白+1%α-酮酸,每組10只大鼠。另取10只雄性SD大鼠行假手術(shù)后予以正常蛋白(18%酪蛋白)含量飼料作對(duì)照組(Sham組)。12周后麻醉處死。留取血、尿和腎臟組織標(biāo)本。應(yīng)用放免法測(cè)定皮質(zhì)勻漿中腎素和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的水平,應(yīng)用ELISA方法測(cè)定血漿

22、中AngⅡ的水平。應(yīng)用real-time PCR、免疫組織化學(xué)和免疫印跡法分別檢測(cè)腎臟局部腎素和AngⅡ的Ⅰ型受體(AT1)的基因和蛋白表達(dá)。比色法測(cè)定腎組織勻漿液中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽髓過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的水平。結(jié)果:1.腎素-血管緊張素系統(tǒng)的改變:NPD、LPD和LK組大鼠的血漿和皮質(zhì)勻漿中AngⅡ水平均較Sham組[血漿AngⅡ:(0.073±0.001)pg/ml:

23、皮質(zhì)勻漿AngⅡ:(20.48±2.34)pg/ml]顯著升高(p值均<0.05),但僅皮質(zhì)勻漿中AngⅡ的水平在LPD組(38.5±5.87)和LK組(30.23±4.23)中較NPD組中(68.92±10.23)顯著降低(p值均<0.05)。皮質(zhì)勻漿中腎素水平僅在LK組(0.16±0.01)中較NPD組中(0.20±0.01)顯著降低(p<0.05)。腎臟局部腎素蛋白的表達(dá)在LPD組(0.4824±0.0640)和LK組(0.336

24、3±0.0267)均較NPD組(0.7805±0.0905)顯著減少(p值均<0.05),分別為NPD組的61.81%和43.09%。腎素基因的水平在LK組中(0.64±0.10)較NPD組(1.11±0.18)和LPD組(1.06±0.15)顯著降低(p值均<0.05),分別是NPD組的57.65%和LPD組的60.37%。腎臟局部AT1蛋白的表達(dá)在LPD組(0.14±0.02)和LK組(0.13±0.01)均較NPD組(0.19±0

25、.02)顯著減少(p值均<0.05),分別為NPD組的74%和68%。AT1a基因的水平在LK組中(0.66±0.17)分別較NPD組(1.16±0.30)和LPD組(0.91±0.29)顯著降低43.11%和27.47%(p值均<0.05)。2.腎臟局部氧化應(yīng)激:NPD、LPD和LK組大鼠的組織勻漿液中MDA含量均顯著高于Sham組(3.9458±0.3953)(p值均<0.05),但其中LK組(5.7220±0.2922)和LPD組

26、(8.9340±0.2363)組織勻漿液中的MDA含量均較NPD組(11.3703±0.7423)顯著減少,LK組的組織勻漿液中MDA含量又較LPD組進(jìn)一步減少(p值均<0.05);而NPD、LPD和LK組大鼠的組織勻漿液中SOD、GSH-Px和CAT水平均顯著低于Sham組[SOD:(152.3860±3.7769);GSH-Px:(88.5448±2.7205);CAT:(1189.2600±95.4250)](p值均<0.05),

27、但在LK組[SOD:(88.5448±2.7205);GSH-Px:(860.9982±18.0659);CAT:(917.6600±30.1156)]和LPD組[SOD:(62.7137±2.3850);GSH-Px:(755.9942±17.3367);CAT:(715.0025±22.9055)]的組織勻漿液中其水平均較NPD組[SOD:(40.8243±3.0096);GSH-Px:(589.5017±21.2464);CAT:

28、(464.0778±20.6500)]顯著升高,在LK組的組織勻漿液中含量又較LPD組進(jìn)一步減少(p值均<0.05)。3.相關(guān)性分析:組織勻漿液中MDA含量(r=0.892)、腎組織TGF-β1表達(dá)(r=0.716)、GSI(r=0.807)和ECM增生評(píng)分(r=0.673)均與組織勻漿液中AngⅡ的水平呈正相關(guān)(p值均<0.001),而組織勻漿液中SOD活力(r=0.978)、GSH-Px活力(r=-0.965)和CAT活力(r=-0