晚期氧化蛋白質產(chǎn)物在慢性腎臟病進展中的作用.pdf

1、研究背景 盡管起始病因不同，腎小球硬化及腎間質纖維化為各種慢性腎臟疾病(CKD)進展過程中的共同發(fā)病通路，是腎功能損害嚴重程度及遠期預后的重要預示標志。參與腎小球硬化及間質纖維化的因素很多，包括細胞因子，生長因子，血管緊張素Ⅱ，內皮素，補體蛋白質，蛋白水解酶，氧化應激及機械因素等。近期研究發(fā)現(xiàn)，各種CKD以及糖尿病病人血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)水平隨腎功能不全的進展而升高，提示AOPPs可能在CKD的發(fā)展過程中發(fā)揮一定作

2、用。 AOPPs的生物化學特征研究表明，發(fā)生氧化損傷的蛋白質主要是白蛋白。在體外用血漿白蛋白與次氯酸作用可得到與慢性腎衰竭(CRF)病人血漿中相似的AOPPs。CRF病人血漿AOPPs水平與雙酪氨酸(蛋白質氧化的標志)及戊糖素(與氧化應激有關的糖化氧化蛋白)密切相關。因此，AOPPs可能是氧化應激過程中血漿蛋白與含氯氧化劑反應的產(chǎn)物，被認為是蛋白質氧化性損傷的新標志。 本研究以大鼠5/6腎切除(5/6Nx)為慢性腎臟病模型

3、，旨在驗證我們提出的假說：AOPPs加速慢性腎臟病腎小球硬化及腎間質纖維化，參與CKD的進展。 研究方法 一.無內毒素AOPPs修飾的大鼠血清白蛋白(AOPPs-RSA)的制備和鑒定，血漿AOPPs濃度按上述方法測定。為去除血脂對吸光度的影響，樣本用PBS1∶5稀釋后4℃13000rpm離心1小時，抽取下層液體檢測。按文獻方法測定腎皮質勻漿AOPPs濃度。 二.實驗動物處理 分兩步行5/6腎切除，第一周切

4、除左腎的2/3，第二周切除右腎。 三.檢測指標 1.腎功能及血壓：使用試劑盒(肌氨酸，N-甲基甘氨酸氧化酶-過氧化物β1濃度。 結果 一.AOPPs慢性負荷對殘腎代償性增生的影響 二.AOPPs慢性負荷對腎組織損傷的影響 5/6腎切除大鼠從術后第5周開始，腎小球硬化指數(shù)和間質纖維化半定量積分增加，并隨時間延長而加重。注射AOPPs-RSA的大鼠(1組)與注射RSA(2組)及PBS(3組)大

5、鼠相比，腎小球硬化指數(shù)在各時間點均顯著增加(P＜0.001)。假手術各組大鼠的組織學檢查未見明顯腎小球硬化及間質纖維化。 以RSA和PBS處理的假手術組大鼠，a-SMA的表達僅局限于血管平滑肌細胞。5/6腎切除術后，其表達顯著增加。5/6腎切除和假手術大鼠注射AOPPs后a-SMA表達均顯著增加。 2.病理組織學觀察：腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，2μm切片，行PAS及Masson染色。在400倍目鏡下，應用顯微鏡網(wǎng)格測

6、位尺計數(shù)每個腎小球所占網(wǎng)格數(shù)，然后用公式計算腎小球體積(GV)。GV=(P×A)3/2×B/K。其中P代表每個腎小球的網(wǎng)格數(shù)；A代表每小格面積；B為1.38，代表腎小球假定作為球體的相關因素；K為1.01，代表腎小球體積有10％的變異系數(shù)。 3.免疫組織化學觀察；用商品化的抗體作免疫組化染色檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細胞(ED-1陽性細胞)浸潤數(shù)量、a-平滑肌肌動蛋白(a-S

7、MA)的表達和Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原的蛋白質表達。 4.RT-PCR：用QiagenRNA提取試劑盒從腎皮質中提取總RNA。 5.氧化應激指標測定：采用硫代巴比妥酸反應法測定腎皮質勻漿硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)濃度。腎皮質勻漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性的測定采用5，5'-二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB)法測定。 6.炎癥反應指標檢測：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELASA)測定尿MCP-1及TGF-β1濃度

8、。 結果 一.AOPPs慢性負荷對殘腎代償性增生的影響 實驗中所有大鼠均存活。5/6腎切除大鼠(1組～3組)的殘腎重量與體重比值(KW/BW)隨時間增加。注射AOPPs-RSA的大鼠(1組)KW/BW值較注射RSA(2組)及PBS(3組)大鼠更高(P＜0.001)。5/6Nx大鼠的腎小球體積亦隨時間而增大。注射AOPPs的1組與作為對照的2組和3組相比有顯著差異(P＜0.01)。三組假手術組中(4組～6組)，注射

9、AOPPs-RSA的4組與5組和6組相比，腎重/體重及腎小球體積均隨時間而增加，第9周和第13周有顯著差異(P＜0.05)。 二.AOPPs慢性負荷對腎組織損傷的影響 5/6腎切除大鼠從術后第5周開始，腎小球硬化指數(shù)和間質纖維化半定量積分增加，并隨時間延長而加重。 與假手術各組比較，假手術各組之間，Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的沉積無顯著差異。 假手術組注射RSA(5組)和PBS(6組)的大鼠腎組織幾乎無巨噬細胞浸

10、潤。假手術組大鼠(4組)巨噬細胞數(shù)也較對照組(5組和6組)增加，但計數(shù)顯著低于5/6腎切除大鼠(P＜0.05)。 三.AOPPs慢性負荷對腎功能的影響 5/6腎切除后大鼠Scr進行性增高，Ccr下降，尿蛋白增加;在五周前收縮壓未升高，但之后逐漸升高。假手術組大鼠未見上述特征。5/6腎切除大鼠長期注射AOPPs后Ccr降低顯著快于注射RSA和PBS的對照組(P＜0.001)，尿蛋白排泄率較對照組明顯增加(P＜0.001)，

11、而收縮壓與對照組相比無明顯差異。假手術大鼠注射AOPPs后也出現(xiàn)蛋白尿，但Scr、Ccr及收縮壓無明顯變化。 四.AOPPs慢性負荷對氧化應激參數(shù)的影響 與相應處理的假手術組相比，5/6腎切除注射RSA(2組)和PBS(3組)大鼠的血漿AOPPs水平升高2.0倍，提示腎大部分切除后AOPPs自發(fā)性產(chǎn)生，且濃度隨時間而增高。5/6腎切除大鼠的腎皮質勻漿中AOPPs濃度也升高。反復注射AOPPs使5/6腎切除和假手術大鼠血漿

12、及腎組織AOPPs水平均顯著升高。與注射PBS對照組相比，實驗第13周時，5/6腎切除大鼠血漿AOPPs水平升高3.0倍，假手術大鼠升高2.0倍。 血漿AOPPs水平與腎小球硬化指數(shù)，腎間質纖維化評分(r=0.817，n=180，P＜0.001)，腎小球巨噬細胞浸潤數(shù)以及腎間質巨噬細胞浸潤數(shù)呈正相關。血漿AOPPs與尿蛋白也呈顯著相關性。 與同樣處理的注射RSA或PBS假手術大鼠相比，5/6腎切除大鼠腎皮質勻漿TBARS

13、水平顯著升高。5/6腎切除和假手術大鼠注射AOPPs后TBARS濃度均增加，與同樣手術方式的RSA和PBS注射組相比有顯著差異。注射RSA(2組)及PBS(3組)的5/6腎切除大鼠較相應處理的假手術大鼠(5組，6組)相比，腎皮質勻漿GSHPx活性降低約40％。 血漿AOPPs與腎組織TBARS顯著相關，腎組織AOPPs水平與腎組織TBARS或GSHPx活性也呈顯著相關性。 五.AOPPs慢性負荷對MCP-1及TGF-β1

14、表達的影響 與假手術組相比，5/6腎切除大鼠尿MCP-1及TGF-β1水平顯著增加，注射AOPPs大鼠(1組)與注射RSA(2組)和PBS(3組)大鼠相比，尿MCP-1和TGF-β1水平升高更為顯著。假手術大鼠注射AOPPs(4組)也引起尿MCP-1及TGF-β1增高。免疫組化研究顯示，假手術組大鼠僅在腎小管上皮細胞有輕微MCP-1或TGF-β1染色。5/6腎切除大鼠腎小球和小管均可見陽性染色，注射AOPPs顯著增加5/6腎切除

15、和假手術大鼠MCP-1和TGF-β1染色。RT-PCR結果顯示，5/6腎切除術后，MCP-1及TGF-β1mRNA表達增加，AOPPs負荷顯著增加MCP-1及TGF-β1mRNA表達。 結論 我們的研究證實，在5/6腎切除模型中，AOPPs是一類促進慢性腎臟病進展的重要新介質。AOPPs蓄積通過氧化還原敏感的炎癥通路促進腎臟纖維化，使腎功能惡化。盡管用動物實驗詮釋臨床疾病需要謹慎，但我們的研究結果揭示了慢性腎組織纖維化和