C-反應蛋白在慢性腎臟病進展中的作用及機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一組進行性發(fā)展的慢性疾病群,其共同的特點是腎功能以不同速度進行性惡化,最終進展為終末期腎衰竭。腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑,是決定腎臟疾病預后的主要因素。腎小管間質(zhì)纖維化表現(xiàn)為淋巴單核細胞浸潤、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在腎間質(zhì)過度沉積以及腎小管萎縮缺失。炎癥反應是腎間質(zhì)纖維

2、化的啟動因子和病理基礎,腎小管上皮細胞在各種一致病因素作用下受損活化,表達釋放趨化因子和生長因子,吸引炎癥細胞浸潤,分泌大量ECM,繼而呈隱匿而累積性的細胞過度凋亡,導致腎小管萎縮缺失,是造成小管間質(zhì)纖維化、腎功能進行性下降的主要因為。
　　 炎癥是導致和加重腎小管間質(zhì)纖維化,促進CKD進展的主要因為。C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)是近年倍受關注的一種促炎癥介質(zhì)。傳統(tǒng)觀點認為CRP只是一種炎癥標志物

3、,但近年來研究發(fā)現(xiàn),CRP本身也是一種炎癥介質(zhì)而主動參與了炎癥和免疫反應過程。CRP作為主要的急性正時相蛋白,屬于五聚體蛋白家族成員之一,在感染、炎癥和組織損傷時的其血清濃度迅速增高。其生物學作用包括與單核巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上的Fcγ受體結合激活受體,介導炎癥反應,如上調(diào)粘附分子,誘導趨化因子產(chǎn)生,募集并激活循環(huán)單核細胞等炎癥細胞。CRP還具有許多類似免疫球蛋白IgG的特性,CRP可以與特定配體結合,激活補體經(jīng)典途徑,加

4、強吞噬細胞的調(diào)理作用等。
　　 研究表明,CKD隨著腎功能的減退,機體出現(xiàn)慢性的全身性炎癥反應,表現(xiàn)為循環(huán)CRP等正性急性時相反應物持續(xù)的低度增多,有學者稱其為“微炎癥狀態(tài)”,CRP是慢性炎癥的標志物。眾多證據(jù)表明,CRP與慢性腎衰竭患者動脈粥樣硬化和心血管病變等并發(fā)癥密切相關。CRP是否對CKD的進展和腎纖維化產(chǎn)生影響仍不清楚,但已有某些證據(jù)提示CRP可能在CKD發(fā)展中起作用。有研究表明,循環(huán)中高水平的CRP能夠與受損的腎組織

5、細胞結合并沉積于包括腎小球、腎小管間質(zhì)、管周微循環(huán)的腎組織中。CRP可誘導腎小球系膜細胞產(chǎn)生活性氧,促進單核細胞趨化蛋白-1表達,并可刺激遠端腎小管上皮細胞激活MAPK轉導通路,誘導合成分泌趨化因子RANTES,提示CRP具有活化損傷腎因有細胞的作用。
　　 慢性腎臟病患者隨著腎功能的減退,往往出現(xiàn)CRP水平的持續(xù)升高,那么CRP作為一種促炎癥介質(zhì)是否反過來促進腎功能進一步惡化,導致CKD進行性發(fā)展?目前還不清楚。因此我們提出C

6、PR可能進一步促進腎功能惡化的假設:慢性腎臟病時循環(huán)中增高的CRP通過受損的腎小球濾過膜,進入腎小管后與腎小管上皮細胞上相應受體結合,使腎小管上皮細胞受損活化,產(chǎn)生炎癥和致纖維化介質(zhì),引起細胞外基質(zhì)合成分泌增多,并誘導腎小管上皮細胞凋亡,從而促進了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展,導致CKD的進行性發(fā)展。
　　 本研究首先從臨床中觀察分析CRP與CKD患者腎功能減退的關系。我們測定了不同時期CKD患者血和尿CRP水平,分析血和尿CRP水平與腎

7、功能的關系,初步探討CRP在慢性腎臟病進展中的潛在作用。然后以體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞為靶細胞,觀察CRP是否上調(diào)其受體-Fcγ受體表達,促進炎癥和致纖維化因子的表達并導致細胞外基質(zhì)分泌增多,以及CRP對腎小管上皮細胞凋亡的影響,從而闡述CRP在CKD進展發(fā)生中的作用和機制,為延緩慢性腎衰竭進行件惡化的防治提供新的治療靶點。
　　 第一章C-反應蛋白與慢性腎臟病腎功能進展的關系
　　 目的：探討CRP對CKD患者腎功能

8、進展的影響。
　　 方法:入選56例尚未接受透析的CKD 3-5期住院患者。以CRP 10 mg/L為分割點,將56例非透析CKD患者分為炎癥組20例和非炎癥組36例。血清和尿CRP水平采用免疫透射比濁法測定。腎小球濾過率(GFR)采用中國人簡化MDRD公式計算。血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)采用酶學法測定。24小時尿蛋白測定用雙縮脲法。放射免疫法測定血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)。根據(jù)CR

9、P不同水平比較腎功能的差異并分析血和尿CRP水平與腎功能減退的相關性。
　　 結論:隨著腎功能的減退而出現(xiàn)的慢性炎癥狀態(tài),其標志物CRP與腎功能的減退密切相關。血清CRP及尿中CRP與腎小球濾過率成負相關,提示CRP本身作為一種重要的促炎介質(zhì)有可能參與了CKD進展的發(fā)生。
　　 第二章C-反應蛋白對腎小管上皮細胞Fcy受體表達的影響
　　 目的：以體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞株(HK-2細胞)為靶細胞,觀察CRP對

10、腎小管上皮細胞Fcγ受體表達的影響并鑒定Fcγ受體的亞型。
　　 方法:以CRP0、0.1、1、10 μg/ml濃度干預HK-2細胞24h,采用RT-PCR和Real-timePCR分別檢測FcγR I(CD64)、FcγR Ⅱ a(CD32a)、FcγRⅢ(CD16)受體mRNA表達。唯有FcγR Ⅱ a(CD32a)mRNA表達。為進一步鑒定CRP對HK-2細胞表面FcγRⅡa表達的影響,HK-2細胞在10μg/ml CRP

11、培養(yǎng)24h后,分別采用流式細胞術、激光共聚焦顯微鏡和Western blot法檢測FcγR Ⅱ a蛋白的表達水平。
　　 結論:人近端腎小管上皮細胞存在FcγRⅡa表達,CRP刺激可上調(diào)腎小管上皮細胞表面的FcγRⅡa受體的表達,提示CRP可以通過對Fcγ RⅡa的結構識別和功能活化介導生物學效應。
　　 第三章 C-反應蛋白對腎小管上皮細胞促纖維化因子和炎癥介質(zhì)表達的影響
　　 目的：觀察CRP刺激是否誘導腎小

12、管上皮細胞致纖維化和炎癥因子表達并導致ECM的積聚。
　　 方法:HK-2細胞分別與0、0.1、1、10、20μg/ml CRP共孵育24h； 101μg/ml CRP培養(yǎng)0、12、24、48h,采用ELISA測定細胞培養(yǎng)上清液中促纖維化因子轉化生長因子β1(TGFβ1)和ECM成分Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、和Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)的水平。以CRP 0、0.1、1、10μg/ml濃度刺激HK-2細胞24h；用10μg/mlC

13、RP培養(yǎng)0h、12h、24h、48h,Real-time PCR TGF β1檢測mRNA表達。以CRP 0、0.1、1、10μg/ml濃度刺激HK-2細胞24h；用10μg/mlCRP培養(yǎng)0h、6h、12h、24h,Real-time PCR檢測趨化因子CX3CLl(Fractalkine)mRNA表達。
　　 結論:CRP刺激上調(diào)腎小管上皮細胞致纖維化因子TGFβ1和趨化因子CX3CL1表達并導致細胞外基質(zhì)Col Ⅰ、Col

14、Ⅳ分泌增多,提示CRP對腎小管上皮細胞的活化具有促炎癥和纖維化作用。
　　 第四章 C-反應蛋白誘導腎小管上皮細胞凋亡
　　 目的：探討CRP對腎小管上皮細胞凋亡的影響
　　 方法:以0、0.1、1、10、20μg/ml CRP和CRP10μg/m1+抗CRP抗體10μg/ml刺激HK-2細胞48小時；10μg/mlCRP孵育HK-2細胞0h、12h、24h、48h,采用AnnexinV-FITC和PI染色,流式

15、細胞術檢測凋亡細胞的百分率。Hoechst33258染色檢測腎小管上皮細胞凋亡的形態(tài)學改變。比色法檢測Caspase-3活性,Real-time PCR檢測凋亡基因BAX、Bc1-2 mRNA的表達。Real-time PCR檢測促進細胞生長停滯與凋亡的基因GADD153 mRNA的表達。
　　 結論:CRP可誘導腎小管上皮細胞凋亡,提示其具有引起腎小管萎縮的潛在能力。誘導凋亡的機制與Caspase-3凋亡酶活化,促凋亡基因BA

16、X、GADD153上調(diào),抑制凋亡基因Bc1-2下調(diào)有關。
　　 第五章 FcγRⅡa受體在C-反應蛋白誘導的生物學效應中的作用
　　 目的：通過FcγRⅡa抗體封閉FcγRⅡa受體,觀察CRP誘導的生物學效應的變化,探討腎小管上皮細胞FcγRⅡa受體在CRP誘導的病理生物學效應中的作用。
　　 方法:以CRP0μg/ml、CRP 10μg/ml、CRP10μg/ml+IgG10μg/ml、CRP10μg/ml+抗

17、FcγRⅡa(CD32a)抗體10μg/ml刺激HK-2細胞24 h或48h,分別采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液TGFβ1濃度和細胞外基質(zhì)ColⅠ、ColⅣ濃度；Real-time PCR檢測TGFβ1和趨化因子CXC3CL1 mRNA表達AnnexinV-FITC和PI染色,流式細胞術檢測凋亡細胞的百分率。
　　 結論:CRP通過腎小管上皮細胞FcγRⅡa受體介導促纖維化因子TGFβ1和趨化因子CXC3CL1表達上調(diào),促進H