黃芪甲苷抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的作用和機制.pdf

1、目前臨床上尚無治療糖尿病腎病的特效藥物，只能通過控制飲食、降糖、降壓等措施進行治療，效果有限。中醫(yī)藥治療歷史悠久，中藥因其多成分、治療多靶點的特點，具有良好的應(yīng)用前景。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌的功效。黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，ASI)是黃芪皂苷的單體成分，具有抗氧化、減輕缺血再灌注損傷等作用，在防治急性腎損傷、膜性腎病、糖尿病腎病等腎臟疾病中發(fā)揮重要作用。目前，對AS

2、I防治糖尿病腎病的報道大多局限于足細胞及系膜細胞，對腎小管間質(zhì)纖維化研究較少，因此本研究擬通過體內(nèi)及體外實驗探討ASI抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的作用和機制。
　　目的:
　　觀察ASI對2型糖尿病模型KKAy小鼠腎組織TGF-β/Smad信號通路及其對高糖誘導(dǎo)下腎小管上皮細胞NRK-52E的影響，探討ASI對腎間質(zhì)纖維化的保護作用及機制，為臨床應(yīng)用ASI提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.動物分組:購入小鼠適應(yīng)

3、性喂養(yǎng)2周，KKAy小鼠予以KK飼料（高脂）喂養(yǎng)至14周，隨機血糖超過13.9mmol/L提示造模成功;血糖水平相近的KKAy小鼠隨機分為模型組（10只）和ASI組（10只），正常飲食的同齡10只雄性C57BL/6J小鼠作為對照組。其中對照組和模型組每日予以生理鹽水予以40mg/kg灌胃，ASI組予以ASI40mg/kg灌胃;
　　2.血糖、血肌酐、尿ACR檢測:每周測量小鼠體重，于第16周、20周、24周采取提尾反射法收集隨機尿

4、液，ELISA試劑盒檢測尿微量白蛋白和尿肌酐，計算尿ACR，尾靜脈取血測血糖，內(nèi)眥取血測血肌酐;
　　3.24周時斷頸處死小鼠，分離腎臟，行HE染色、Masson染色觀察各組腎臟病理變化;
　　4.應(yīng)用免疫組化染色檢測各組腎臟TGF-β1、Smad2/3、α-SMA的表達;
　　5.ASI對NRK-52E細胞活力的影響:NRK-52E細胞生長至融合狀態(tài)時，同步化培養(yǎng)24小時，以不同濃度的ASI（0、10、20、40、8

5、0、100μg/ml，依次簡寫為0、ASI10、ASI20、ASI40、ASI80、ASI100）刺激NRK-52E細胞24小時，細胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測細胞活性;
　　6.ASI對高糖誘導(dǎo)下NRK-52E細胞凋亡的影響:①細胞長至融合狀態(tài)時，同步化培養(yǎng)24小時，設(shè)正常對照組、高糖組、ASI各組:高糖DMEM中加入ASI，濃度分別為20、40、80、100μg/ml(依次簡寫為HG+ASI20、HG+ASI40、HG+ASI8

6、0、HG+ASI100)，分別刺激NRK-52E細胞24小時，或②用高糖+ASI100μg/ml分別刺激細胞0、4、8、12、24、48小時，用AnnexinⅤ-FITC PI試劑盒檢測細胞凋亡;
　　7.ASI對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細胞Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1表達的影響:細胞生長至融合狀態(tài)時，同步化培養(yǎng)24小時，設(shè)正常對照組、高糖組、ASI各組（同前述），分別刺激NRK-52E細胞24小時，以Real

7、-Time PCR檢測Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1核酸水平的表達，Western Blot檢測Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、TGF-β1蛋白水平的表達;
　　8.統(tǒng)計學(xué)方法:計量資料以均數(shù)±標準誤表示，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均由統(tǒng)計軟件SPSS19.0完成，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異

8、有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.一般狀態(tài):對照組小鼠精神狀態(tài)好，反應(yīng)靈敏，毛色順滑;模型組小鼠精神萎靡不振，步履遲緩，煩渴多尿，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)無光澤，且隨著周齡的增加，上述癥狀更加明顯。ASI組小鼠的狀態(tài)介于上述兩組之間。在16、20、24周齡時，模型組及ASI組小鼠體重均比同齡對照組小鼠大（均P＜0.01）;與模型組小鼠相比，ASI組體重增長減緩（均P＜0.05）;
　　2.血糖、血肌酐、尿ACR檢測:在各觀

9、察時間點，與同齡對照組相比，模型組及ASI組血糖、尿ACR明顯升高（均P＜0.01）;與同齡模型組相比，ASI組血糖、尿ACR較低(P＜0.05，P＜0.01)。三組小鼠血清肌酐檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);
　　3.各組小鼠腎組織病理改變:光鏡下可觀察到對照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，系膜細胞數(shù)量正常，間質(zhì)中未見炎細胞浸潤及纖維化;模型組腎小球肥大，系膜基質(zhì)增寬，系膜細胞增多，腎小管上皮細胞胞漿出現(xiàn)空泡、腎小管腔可見透明管

10、型，腎間質(zhì)炎癥細胞增多，充血水腫;ASI組腎小球及系膜區(qū)改變介入對照組及模型組之間，腎小管上皮細胞輕度腫脹，胞漿較少，未間明顯的間質(zhì)纖維化;
　　4.免疫組化染色檢測各組腎臟TGF-β1、Smad2/3及α-SMA的表達情況:α-SMA、TGF-β1及Smad2/3主要在腎小管-間質(zhì)表達;對照組少見TGF-β1表達，而模型組及ASI組TGF-β1表達增強（P＜0.01，P＜0.05），與模型組相比，ASI組TGF-β1表達減弱(P

11、＜0.01);對照組α-SMA多數(shù)表達于腎血管平滑肌，在腎小管間質(zhì)偶有表達，但在模型組可見α-SMA在腎小管上皮細胞、腎小管周圍均有所表達(P＜0.01)，與模型組相比，ASI組α-SMA表達明顯下調(diào)(P＜0.01);對照組腎小管與腎小球細胞核有少量Smad2/3表達，模型組及ASI組表達增加(P＜0.01，P＜0.05)，但同模型組比較，ASI組Smad2/3表達減少(P＜0.01);
　　5.ASI對NRK-52E細胞活力的影

12、響:不同濃度ASI分別作用于NRK-52E細胞24小時，各組之間細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;
　　6.ASI對高糖誘導(dǎo)下NRK-52E細胞凋亡的影響:與對照組相比，高糖組細胞凋亡增加（P＜0.01），加入ASI后，HG+ASI40、HG+ASI80、HG+ASI100組的細胞凋亡均較高糖組減輕（均P＜0.05）;HG+ASI100μg/ml作用于細胞8h后，細胞凋亡顯著受抑，且隨著時間的延長，此作用有逐漸增強的趨勢（

13、與0h相比，均P＜0.05）;
　　7.ASI對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細胞Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1mRNA的影響:與對照組相比，高糖組(HG)、HG+ASI20組Smad2、TGF-β1mRNA表達上調(diào)（均P＜0.01），Smad3表達上調(diào)(均P＜0.05)，HG、HG+ASI20、HG+ASI40α-SMA表達上調(diào)（均P＜0.01）;與HG相比，HG+ASI80、HG+ASI100組α-SMA、Smad

14、3mRNA表達下調(diào)（均P＜0.05），HG+ASI40、HG+ASI80、HG+ASI100TGF-β1表達下調(diào)（均P＜0.01），HG+ASI20、HG+ASI40、HG+ASI80、HG+ASI100Smad2表達下調(diào)(P＜0.05);
　　8.ASI對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細胞Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、TGF-β1蛋白水平的影響:與對照組相比，高糖組(HG)、HG+ASI20、HG

15、+ASI40組α-SMA、Smad2、Smad3表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01),p-Smad2、p-Smad3在HG、HG+ASI20、HG+ASI40、HG+ASI80組表達均上調(diào)（均P＜0.01），TGF-β1在HG、HG+ASI20組表達上調(diào)（均P＜0.01）;與HG相比，HG+ASI80、HG+ASI100組α-SMA、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05

16、），TGF-β1在HG+ASI40、HG+ASI80、HG+ASI100組表達下調(diào)(均P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.黃芪甲苷可減輕糖尿病KKAy小鼠的高血糖、肥胖及尿ACR，但不影響血肌酐;
　　2.黃芪甲昔可改善糖尿病KKAy小鼠的腎小管間質(zhì)纖維化，其作用機制可能與ASI下調(diào)TGF-β/Smad信號通路有關(guān);
　　3.黃芪甲苷可呈劑量及時間依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細胞凋亡;
　　4.黃芪