新化合物RapA對糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制.pdf

1、【目的】：
　　通過體內(nèi)外實驗,探討新化合物RapA對糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制。
　　【方法】：
　　1.體內(nèi)實驗:建立大鼠DN模型,Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組和RapA治療組。采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量(35mg/kg)STZ注射誘導(dǎo)Wistar大鼠2型糖尿病模型。正常對照組給予注射等體積的枸櫞酸緩沖液(0.1mol/L,PH值4.5),72h后測定餐后血糖(PBG)≥11.1mmol

2、/L確定為DM模型。糖尿病模型建立后,RapA治療組分別給于灌胃口服RapA(2.5mg/kg/d和5.0mg/kg/d)。觀察大鼠一般情況,測體重;采用ELISA和化學(xué)法檢測空腹葡萄糖、空腹胰島素、血脂和24h尿蛋白等;采用口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)檢測長期口服RapA對2型糖尿病大鼠糖耐量功能的影響;RapA干預(yù)12周后處死大鼠,留取大鼠腎組織做Masson染色;采用免疫印跡法(Westernblot)檢測TGF-Smad信號通

3、路、MAPK、NADPH氧化酶、PKC等蛋白表達(dá)水平。
　　2.體外實驗:以人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)為研究對象,利用WST-1確定RapA對HK-2細(xì)胞的IC50;細(xì)胞分組為:A.正常糖對照組(NG,D-Glucose5.5mM)、B.溶媒組(DMSO)C.高糖組(HG,D-Glucose30mM)、C.高糖+RapA組(HG+RapA200nM);Westernblot檢測E-cadherin、α-SMA、FN和LN的

4、蛋白表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平。
　　【結(jié)果】：
　　1.一般生化指標(biāo)顯示,模型組大鼠空腹胰島素、空腹血糖、血脂、24小時尿蛋白排泄量水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對照組大鼠,體重則下降明顯(P<0.05)。RapA治療組相比于模型組,空腹胰島素、空腹血糖、總膽固醇、FFA、24小時尿蛋白等水平下降明顯(P<0.05),體重?zé)o明顯差異(P>0.05);
　　2.口服葡萄糖耐量試驗顯示,模型組相比于正常組,0、30

5、、60、90和120分鐘五個時間點全血葡萄糖水平明顯升高(P<0.05),RapA治療組相對于模型組,0、30、60、90和120分鐘五個時間點全血葡萄糖水平部分降低(P<0.05),但仍高于正常組;
　　3.Masson染色結(jié)果顯示,正常對照組無明顯異常,模型組腎間質(zhì)纖維化明顯,RapA治療組相比于模型組,腎間質(zhì)膠原沉積減少,尤其以5.0mg/kg/d明顯(P<0.01);
　　4.腎組織Westernblot結(jié)果顯示,R

6、apA治療組較模型組,TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3、Smad4、NADPH氧化酶(p67phox、p47phox、p40phox、p22phox)、MAPK和磷酸化PKC-α/β等蛋白表達(dá)水平均明顯下降,SOD-1表達(dá)增多(P<0.05);
　　5.利用不同濃度的RapA干預(yù)HK-2細(xì)胞,并計算出藥物濃度與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)聯(lián),計算出RapA在HK-2細(xì)胞的IC50為361.7～381.7nM;
　　6.細(xì)胞

7、Westernblot結(jié)果顯示:相對于正常糖對照組,高糖可引起HK-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA、FN和LN增多,而E-cadherin蛋白水平減少(P<0.05);RapA200nM干預(yù)后,α-SMA、FN和LN表達(dá)明顯下降,E-cadherin蛋白表達(dá)增加(P<0.05),正常糖對照組和溶媒組無明顯差異(P>0.05);
　　7.RapA可明顯降低高糖刺激下HK-2細(xì)胞活性氧產(chǎn)生水平(P<0.05)。
　　【結(jié)論】：
　　

8、1.RapA可降低代謝相關(guān)危險因素,例如空腹胰島素、空腹血糖、總膽固醇和游離脂肪酸等,改善糖耐量異常,明顯降低24h尿蛋白排泄量水平;
　　2.RapA能下調(diào)腎組織TGF-Smad通路、MAPK、NADPH氧化酶、PKC相關(guān)蛋白的表達(dá),減輕糖尿病腎間質(zhì)纖維化的程度;
　　3.高糖可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞α-SMA、FN和LN蛋白表達(dá)增多,E-cadherin蛋白表達(dá)減少,提示高糖可刺激HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT;RapA可抑制HK-2