去甲斑蝥素對糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的作用及機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)已成為終末期腎功能衰竭的重要原因之一。DN早期可出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化，且不依賴腎小球病變直接促進。腎功能水平下降。阻止DN腎小管間質(zhì)纖維化已成為當前的研究熱點。然而目前尚沒有理想的逆轉(zhuǎn)DN腎小管間質(zhì)纖維化的藥物。
　　 去甲斑蝥素(Norcantharidin NCTD)是人工合成的斑蝥素衍生物。本研究所兩位博士研究生前期研究發(fā)現(xiàn)：NCTD能減輕蛋白負荷大鼠和梗阻性腎病

2、大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度；體外實驗證實NCTD能抑制白蛋白刺激的腎小管上皮細胞NF-κB和CTGF的表達；阻止TGF-β1介導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。我們推測NCTD是一種極有前景的抗腎間質(zhì)纖維化藥物。但NCTD對DN腎小管間質(zhì)纖維化的作用如何尚不清楚。
　　 鈣調(diào)蛋白磷酸酶(Calcineurin CaN)在腎組織尤其腎小管上皮細胞上表達，研究證實CaN在促進DN腎小球硬化過程中起重要作用，但尚無其在DN腎間質(zhì)纖維化過程中的研究

3、。據(jù)報道NCTD是CaN的抑制劑，NCTD是否通過抑制DN腎小管上皮細胞CaN信號通路，發(fā)揮抗DN腎間質(zhì)纖維化的作用亟待深入研究。
　　 目的：本課題擬通過DN動物模型和高糖刺激的腎小管上皮細胞模型，從三個方面進行研究：1.觀察NCTD對2型糖尿病腎病大鼠。腎小管間質(zhì)纖維化的影響；2.觀察NCTD對高糖刺激的HK-2細胞細胞外基質(zhì)和TGF-β1表達的影響；3.研究NCTD對糖尿病腎病腎小管上皮細胞CaN表達的影響，探討NCTD抗

4、DN腎間質(zhì)纖維化與其抑制CaN的關系。通過本研究不但可擴大NCTD的適應癥，而且為將其開發(fā)成為治療DN，延緩腎功能進展的有效藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：1.建立2型DN大鼠模型：SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和NCTD治療組。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ注射誘發(fā)SD大鼠2型糖尿病腎病模型(STZ溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5)，對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72h后測定血糖和尿糖，血糖

5、值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者確定為DM模型。成模后，NCTD治療組予以腹腔注射去甲斑蝥素(0.05mg/kg/d和0.1mg/kg/d)。分別于第3、8周末處死大鼠，耿部分腎皮質(zhì)組織置于4％多聚甲醛固定，觀察各組之間腎臟病理學變化。采用免疫組化方法檢測FN、ColⅣ、TGF-β1和CaN分布以及表達情況。
　　 2.常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，無血清DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，細胞分組：(1)正常糖組(NG，D

6、-Glucose5.5mmol/L)，(2)甘露醇對照組(NG+M，D-Glucose5.5 mmol/L+mannitol24.5 mmol/L)，(3)高糖組(HG，D-Glucose30mmol/L)，(4)高糖+NCTD(D-Glucose30 mmol/L+NCTD2.5，5，mg/L)。臺盼藍排斥實驗檢測NCDT對高糖刺激的細胞毒性。MTT法檢測NCTD對高糖刺激的細胞增殖的影響。收集培養(yǎng)6、24、48h后細胞總RNA及蛋白

7、，用實時定量PCR檢測細胞FN、ColⅣ、TGF-β1和CaN mRNA水平的表達，采用間接細胞免疫熒光法檢測CaN下游NFATc在細胞分布，采用Western blot檢測FN、ColⅣ、TGF-β1、CaN和NFATc蛋白蛋白水平的表達。
　　 3.常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，轉(zhuǎn)染CaN siRNA，細胞分5組：(1)正常糖組(NG，D-Glucose5.5mmol/L)，(2)高糖組(HG，D-Glucose30 mmol/L)

8、，(3)高糖+CaNsiRNA組，用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將帶綠色熒光的CaN siRNA轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，24h后培養(yǎng)于30mM D-葡萄糖的DMEM中，(4)高糖+CaN siRNA+NCTD組。細胞轉(zhuǎn)染CaN-SiRNA24h后，用5ug/ml NCTD預處理15min后培養(yǎng)于30mMD-葡萄糖的DMEM中，(5)高糖+NCTD組：用5ug/ml NCTD預處理15min后再用30mM D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)中。

9、轉(zhuǎn)染后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，檢測轉(zhuǎn)染效率。采用Western-blot及實時定量PCR檢測CaN蛋白及RNA表達水平，明確CaN siRNA干擾效果。采用Western blot比較NCTD對HK-2表達FN，ColⅣ及TGF-β1的影響與其抑制CaN的關系。
　　 結果：1.成功構建DN模型：72h測定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++，確定為糖尿病模型。8周末時，糖尿病大鼠的血糖顯著高

10、于正常對照組，且出現(xiàn)了明顯的“三多一少”癥狀，檢測尿白蛋白明顯增高，Masson染色腎小管間質(zhì)出現(xiàn)明顯的膠原沉積，說明DN大鼠模型建立是成功的。NCTD組與模型組比較，能減小腎小管間質(zhì)膠原相對面積(P＜0.05)，下調(diào)腎小管區(qū)膠原Ⅳ，F(xiàn)N的表達，以及TGF-β1蛋白的表達(P＜0.05)。
　　 2.正常大鼠小腎小管有少量CaN蛋白表達，8周末糖尿病腎組織CaN蛋白表達增加，NCTD以劑量依賴方式抑制CaN的表達(P<0.05)

11、。
　　 3.臺盼藍實驗結果提示，不同濃度NCTD作用72小時后，濃度超過5mg/L的NCDT對高糖環(huán)境下的HK-2細胞有明顯的毒性。MTT實驗結果提示，NCTD2.5mg/L和5mg/L干預組能抑制HG誘導的HK-2細胞的增殖(P<0.05)，5mg/LNCTD的抑制作用更強些。所以，體外實驗選擇NCTD2.5mg/L和5mg/L兩個濃度組。
　　 4.實時定量PCR和Western blot結果顯示：30mM D-葡

12、萄糖可引起HK-2細胞表達FN，ColⅣ和TGF-β1 mRNA以及蛋白水平的升高(P＜0.05)，而NCTD可抑制高糖刺激的FN，ColⅣ和TGF-β1的表達(P<0.05)。30mM D-甘露醇對上述指標均無影響(P>0.05)。
　　 5.實時定量PCR和Western blot結果顯示：30mM D-葡萄糖可導致HK-2細胞表達CaN mRNA以及蛋白水平的升高，而NCTD在基因以及蛋白水平均可抑制CaN的表達(P＜0.

13、05)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，CaN下游NFATc在正常對照組中存在于胞漿，高糖刺激后細胞核內(nèi)開始表達，高糖刺激30min后發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，去甲斑蝥素能在一定程度上抑制核轉(zhuǎn)位的發(fā)生，減少高糖刺激后核內(nèi)NFATc的表達。
　　 6.轉(zhuǎn)染CaN-SiRNA后，高糖刺激后HK-2細胞中CaN mRNA以及蛋白表達均減少，而FN，ColⅣ以及TGF-β1蛋白水平表達都明顯增強(P<0.05)。相比于CaN-SiRNA組，NCTD可抑制高糖刺激