去甲斑蝥素對(duì)尿蛋白和腎間質(zhì)纖維化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、蛋白尿不僅是腎臟疾病的主要臨床表現(xiàn)，其本身也作為獨(dú)立的致病因子直接參與腎臟病理損害過程，導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性減退。研究表明，尿蛋白含量可作為反映各種原發(fā)性腎臟疾病療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)。如何有效降低尿蛋白，延緩腎臟病進(jìn)展一直是腎病學(xué)界普遍關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前臨床上對(duì)蛋白尿的治療以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，但兩者都存在副作用大，療效欠佳的弊端。 斑蝥素是從鞘翅目芫菁科昆蟲斑蝥中提取的一種活性成分，在癌癥治療方面具有獨(dú)特療效。但因其

2、毒性較大，臨床應(yīng)用受到限制。去甲斑蝥素(NCTD)是斑蝥素的重要衍生物，具有毒性低，藥理作用更明確的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)已證實(shí)去甲斑蝥素可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。目前發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與caspase家族和Bcl-2家族密切相關(guān)，同時(shí)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和survivin蛋白也參與了此過程。另一方面，去甲斑蝥素可下調(diào)核因子κB(NF-κB)及Smad3的表達(dá)，調(diào)節(jié)基質(zhì)

3、金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)的比值，從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)粘附及局部新生血管的形成，維持細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡。此外，去甲斑蝥素還具有抗炎，調(diào)節(jié)免疫的作用，用于治療風(fēng)濕痛、銀屑病等免疫性疾病也有特效。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥素呈劑量依賴性抑制成纖維細(xì)胞株(NIH/3T3細(xì)胞)增殖，對(duì)防治器官組織纖維化也有一定作用。 原發(fā)性腎小球疾病是一種免疫性疾病，蛋白尿與腎組織炎癥、纖維化及相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。結(jié)合上

4、述斑蝥素的藥理作用特點(diǎn)可見，用斑蝥素治療腎臟疾病具有理論依據(jù)。因此，本研究選用去甲斑蝥素(NCTD)干預(yù)蛋白超負(fù)荷腎病大鼠，旨在觀察其對(duì)模型大鼠蛋白尿及腎間質(zhì)纖維化的影響，并從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制。 本論文分為四部分：第一部分為NCTD干預(yù)蛋白超負(fù)荷腎病大鼠，觀察NCTD對(duì)模型大鼠蛋白尿及腎間質(zhì)纖維化的影響。第二部分應(yīng)用RT-PCR、免疫組化及Western blot的方法，檢測(cè)NCTD對(duì)蛋白超負(fù)荷腎病大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因

5、子(CTGF)基因和蛋白表達(dá)水平的影響。第三部分觀察NCTD對(duì)蛋白超負(fù)荷腎病大鼠核因子v．B(NF-κB)表達(dá)水平的影響。第四部分觀察NCTD對(duì)白蛋白刺激近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)增殖及上調(diào)纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響。 目的：建立蛋白超負(fù)荷腎病大鼠模型，觀察NCTD對(duì)腎病大鼠蛋白尿及腎臟間質(zhì)纖維化的影響，并通過檢測(cè)腎組織中CTGF和NF-κBp65的基因和蛋白表達(dá)水平(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))，及觀察NCTD對(duì)白蛋白刺激HK-2增殖及

6、上調(diào)FN表達(dá)的影響(體外實(shí)驗(yàn))，初步探討NCTD對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響及機(jī)制，為NCTD用于腎臟病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、所有SD大鼠均行單側(cè)腎切除術(shù)。實(shí)驗(yàn)組大鼠予以腹腔注射牛血清白蛋白(BSA)，建立蛋白超負(fù)荷腎病模型后隨機(jī)分為模型組(BSA組，腹腔注射BSA 5g/(kg·d))、NCTD組(腹腔注射BSA 5g/(kg·d)和NCTD 0.1mg/(kg·d))和甲基強(qiáng)的松龍組(MP組，腹腔注射BSA 5g

7、/(kg·d)和MP 1mg/(kg·d))；對(duì)照組(Saline組)僅注射等量生理鹽水。第9周末處死大鼠。檢測(cè)血常規(guī)及生化指標(biāo)，各時(shí)相尿蛋白定量；腎組織行光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。 2、實(shí)驗(yàn)分組及處理同方法1。免疫組織化學(xué)法及Western blot法對(duì)腎組織CTGF的表達(dá)進(jìn)行定位及半定量分析；RT-PCR法檢測(cè)腎組織中CTGF mRNA的表達(dá)水平。 3、實(shí)驗(yàn)分組及處理同方法1。免疫組織化學(xué)法對(duì)腎組織NF-κBp65的

8、表達(dá)進(jìn)行定位及半定量分析；RT-PCR法檢測(cè)腎組織NF-κBp65 mRNA的表達(dá)水平。 4、通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)HK-2細(xì)胞無明顯損傷的NCTD適合濃度。將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(1640培基組)，白蛋白組(1640+白蛋白5g/L)，各濃度NCTD組(1640+白蛋白5g/L+NCTD 0.5，1，2.5mg/L)。在各組HK-2細(xì)胞中加入相應(yīng)干預(yù)液孵育24h后，采用細(xì)胞增殖法(MTT法)檢測(cè)NCTD對(duì)白蛋白刺

9、激HK-2細(xì)胞增殖的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定各組細(xì)胞上清中FN的蛋白含量；RT-PCR法半定量分析HK-2細(xì)胞中FN mRNA的表達(dá)。 結(jié)論： 1、一定濃度去甲斑蝥素可降低蛋白超負(fù)荷腎病大鼠的尿蛋白，改善腎小管間質(zhì)病理損傷程度，且無明顯肝腎毒性及骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)。 2、去甲斑蝥素可通過下調(diào)蛋白超負(fù)荷腎病大鼠CTGF和NF-κBp65的表達(dá)水平，延緩腎間質(zhì)纖維化。 3、白蛋白(5g/L