去甲斑蝥素對激素非依賴前腺癌DU145細(xì)胞作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是歐美國家男性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第二位。最新的資料顯示，美國2010年前列腺癌新發(fā)病例為217730例，占所有腫瘤的28％;2010年美國有32050人死于前列腺癌，占所有因腫瘤死亡者的11％。我國前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國家，但由于生活方式西化、人口老齡化及前列腺特異抗原(PSA)篩查的普及，近10年來前列腺癌的發(fā)病率呈直線上升的態(tài)勢，前列腺癌的發(fā)病率及死亡率顯著上升，已成為影響中國男性健康的重

2、要疾病之一，應(yīng)受到更多的重視。
　　 早期局限性前列腺癌一般采用手術(shù)或局部放療，對于晚期前列腺癌，內(nèi)分泌治療是多年來公認(rèn)的有效治療方法。在內(nèi)分泌治療開始階段，絕大多數(shù)患者可以達(dá)到腫瘤縮小，血清前列腺特異性抗原(PSA)下降，骨痛減輕，尿路梗阻和出血癥狀緩解，體力狀況改善。但是，相當(dāng)一部分患者在內(nèi)分泌治療中位時間14～30個月后，前列腺癌從對激素依賴逐漸變?yōu)閷に夭幻舾?，成為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。CRPC一旦出現(xiàn)，治療就

3、比較困難，且嚴(yán)重威脅患者的生命。在去勢抵抗性前列腺癌中，化療占有重要的地位。目前，以多西紫杉醇為基礎(chǔ)的化療已經(jīng)成為一線的化療方案。紫杉醇類藥物的主要作用機(jī)制是在G2/M期抑制微管解聚，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞有絲分裂障礙，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在M期。研究表明，多西紫杉醇在三期實(shí)驗(yàn)中對病人生存期有益處，而且能夠減少患者疼痛、提高患者的生活質(zhì)量。多西紫杉醇的主要副作用是嗜中性白血球減少癥、骨髓抑制等，這些副作用限制了對老年體弱的晚期前列腺癌患者應(yīng)用。非常

4、遺憾的是，相當(dāng)一部分去勢抵抗性前列腺癌患者對多西紫杉醇無反應(yīng)，而且?guī)缀跛械娜莸挚剐郧傲邢侔┗颊叨甲罱K發(fā)生藥物抵抗。那么找到一種對骨髓抑制小，甚至能升高白細(xì)胞的抗腫瘤藥物作為輔助或者聯(lián)合紫杉醇類藥物治療前列腺癌，以減少紫杉醇類藥物的副作用，減少其耐藥性，可能優(yōu)化為去勢抵抗性前列腺癌的化療。
　　 去甲斑蝥素(簡稱NCTD)是斑蝥素的衍生物，是我國自主研發(fā)的抗腫瘤藥物，與斑蝥素構(gòu)型相似，唯1、2位無甲基。去除兩個甲基后，NCTD

5、的泌尿系刺激作用基本消失，而且保留了抗癌活性。NCTD目前臨床主要用于治療原發(fā)性肝癌、食道癌、胃癌、乙型肝炎以及銀屑病等。NCTD的抗腫瘤作用有其獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)。研究表明，NCTD相比其他的化療藥物，其骨髓抑制作用較小，而且有升高白細(xì)胞的功能。NCTD的這些優(yōu)點(diǎn)正好彌補(bǔ)多西紫杉醇造成的副作用缺陷。此外，現(xiàn)有研究表明，NCTD的抗腫瘤作用途徑的多樣性，可能延緩腫瘤耐藥的發(fā)生，其作用主要有:1、NCTD抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，且隨著NCTD濃度

6、的增加抑制率逐漸增加;2、NCTD可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞Cdc6蛋白的降解，Cdc6蛋白是起始DNA復(fù)制所必須的調(diào)節(jié)蛋白，NCTD可能通過抑制Cdc6蛋白而抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制;3、NCTD可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，NCTD誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中伴有Caspase的活化、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的功能調(diào)節(jié)。近期的研究表明，NCTD誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡受到細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶通路的調(diào)節(jié)，凋亡伴有JNK途徑的活化。發(fā)現(xiàn)在NCTD誘導(dǎo)的HeLa細(xì)

7、胞凋亡過程中ERK和JNK的激活發(fā)揮了重要作用。
　　 前復(fù)制復(fù)合體（簡稱pre-RC）是真核細(xì)胞起始DNA復(fù)制所必須的調(diào)控因子，包括Orc、Cdc6、Cdt1和Mcm2-7，其中Cdc6(cell division cycle6 homolog)蛋白具有癌基因的功能，可促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，通過抑制Cdc6可以產(chǎn)生抗腫瘤作用。Cdc6已經(jīng)被證實(shí)可作為有效的抗腫瘤靶點(diǎn)。首先，Cdc6在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)極低或

8、沒有表達(dá)，而且其表達(dá)與組織的惡性增生進(jìn)程相關(guān)。其次，一些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素，如:射線照射、TNF以及一些抗腫瘤藥物可抑制Cdc6蛋白。另外，通過RNA干擾的方法抑制Cdc6，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果表明，NCTD可以導(dǎo)致DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6的裂解。在哺乳動物包括人的細(xì)胞中，Cdc6蛋白在兩方面發(fā)揮功能。一方面，在G1期參與起始DNA的復(fù)制。真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始需要一個被稱為“復(fù)制前復(fù)合體(簡稱pre-RC)”的組裝，即

9、pre-RC中的蛋白組分先后被招募到DNA復(fù)制起始位點(diǎn)，一起構(gòu)成pre-RC后才能起始DNA的復(fù)制。在G1期這個“復(fù)制前復(fù)合體的組裝最為重要的一環(huán)就是Cdc6與DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的結(jié)合，然后才能啟動后續(xù)Mcms才能結(jié)合于染色體上完成pre-RC的組裝。如果Cdc6功能被抑制，細(xì)胞將不能完成pre-RC的組裝，DNA復(fù)制也將受到抑制。另一方面，在S期Cdc6參與調(diào)控S-G2/M細(xì)胞周期進(jìn)程。Cdc6通過激活監(jiān)測點(diǎn)蛋白Chk1而抑制細(xì)胞的有

10、絲分裂，確保細(xì)胞在S期結(jié)束前不會進(jìn)入M期，協(xié)調(diào)細(xì)胞DNA的復(fù)制與有絲分裂的正常進(jìn)程。
　　 Cdc6與前列腺癌:在前列腺癌中，Cdc6參與雄激素受體(AR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雄激素在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，前列腺癌初期大多表現(xiàn)為雄激素依賴性，但一般經(jīng)過中位時間（18-24個月）后會轉(zhuǎn)化為去勢抵抗性前列腺癌。一旦發(fā)展為AIPC其預(yù)后較差，此時一般臨床使用多西紫杉醇治療，但往往最終也會產(chǎn)生耐藥。近來研究發(fā)現(xiàn)，在雄激素依賴性前

11、列腺癌中，雄激素處理會導(dǎo)致Cdc6的高表達(dá)，進(jìn)一步研究證實(shí)AR可作為轉(zhuǎn)錄因子與cdc6基因啟動子結(jié)合促進(jìn)cdc6的轉(zhuǎn)錄。Cdc6的高表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)前列腺癌的惡性轉(zhuǎn)化。
　　 鑒于目前紫杉醇類藥物去勢抵抗性前列腺癌化療缺點(diǎn)、Cdc6在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用以及Cdc6與前列腺癌的密切關(guān)系、前期試驗(yàn)中NCTD能夠裂解腫瘤細(xì)胞中的Cdc6，NCTD可能成為抗擊激素非依賴性前列腺癌的化療藥物，Cdc6可能成為

12、抗擊前列腺癌的一個有效靶點(diǎn)。
　　 研究目的和方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)共分為4部分:
　　 第一部分:探索NCTD是否對激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞有抗腫瘤作用。
　　 目的:檢測去甲斑蝥素(NCTD)是否對前列腺癌細(xì)胞有抑制作用。
　　 方法:MTT試驗(yàn)。將處在指數(shù)增長期的前列腺癌細(xì)胞株DU145細(xì)胞，計(jì)數(shù)鋪板后，加入不同濃度的NCTD作用48 h，再加入MTT工作液20μl，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h

13、，小心吸出上層液體，每孔加入200μlDMSO溶解。測490nm下的吸光度值。每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，MTT試驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 第二部分:探索NCTD是否能抑制DU145細(xì)胞DNA合成及其機(jī)制目的:由于真核細(xì)胞的分裂增殖前提是DNA的復(fù)制合成，在第一部分的實(shí)驗(yàn)表面，NCTD能有效抑制DU145細(xì)胞的增殖，因此探索NCTD是否是通過抑制DNA的復(fù)制來產(chǎn)生其抑制作用，并且更進(jìn)一步深入探索在NCTD對復(fù)制起始復(fù)合物中各個蛋白的影響。1

14、、檢測NCTD是否能夠抑制DU145細(xì)胞DNA合成;2、探索NCTD對DU145細(xì)胞復(fù)制起始復(fù)合物(Pre-RCs)的影響;4、探索NCTD對Pre-RCs的組裝的影響。
　　 方法:1、BrdU摻入標(biāo)記試驗(yàn)。BrdU在DNA合成期（S期）可代替胸腺嘧啶，而后利用抗Brdu單克隆抗體，顯示DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖情況。將生長良好的DU145細(xì)胞接種到載玻片上，放入六孔板中培養(yǎng)，在六孔板中加入或不加入100uM的NCTD，作用24h，

15、然后行BrdU摻入標(biāo)記試驗(yàn);2、q-PCR、免疫印跡(WB):選擇生長良好的DU145細(xì)胞，以5*105個/孔鋪板，24h后加入不同濃度的NCTD處理，作用48h后，收集細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后做q-PCR，收取其中的蛋白，做western blotting試驗(yàn)，檢測在不同濃度NCTD作用48h后，前復(fù)制復(fù)合體(Pre-RCs)中各個蛋白質(zhì)組分的含量變化;3、chromatin-binding試驗(yàn):由于前復(fù)制復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)中合成，要到

16、細(xì)胞核中與染色體結(jié)合來發(fā)揮其作用，因此我們進(jìn)一步探索在NCTD作用以后，DU145細(xì)胞中的前復(fù)制復(fù)合體的蛋白與染色體結(jié)合的情況，而且為了消除各個細(xì)胞處于細(xì)胞周期的不同階段的影響，我們采用細(xì)胞同步化的方式，先將細(xì)胞用mimosin同步化在G1期，然后選取不同時間點(diǎn)，觀察DU145前復(fù)制復(fù)合體的含量及與染色體結(jié)合的情況。細(xì)胞首先選取生長良好的DU145細(xì)胞，鋪板然后進(jìn)行利用mimosin同步化20 h，將細(xì)胞同步化在G1期，然后去除mimo

17、sin，釋放細(xì)胞使細(xì)胞進(jìn)入正常的周期進(jìn)程，在釋放之前8h，加入或者不加入NCTD，然后與釋放后的0h，3h，6h收集細(xì)胞，分離與染色體結(jié)合的蛋白和未與染色體結(jié)合的蛋白，將這些蛋白樣品行western blotting，檢測Pre-RCs中各個相關(guān)蛋白的含量變化。
　　 第三部分:NCTD誘導(dǎo)產(chǎn)生有絲分裂災(zāi)變的研究
　　 目的:前兩部分的實(shí)驗(yàn)表面NCTD能夠減少DU145細(xì)胞中Cdc6的含量，并且能夠抑制Cdc6與染色體的

18、結(jié)合。由于以往的研究稱Cdc6不僅在G1期前復(fù)制復(fù)合體(Pre-RC)的組裝發(fā)揮作用，在S期Cdc6參與調(diào)控S-G2/M細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控，以保證細(xì)胞在DNA復(fù)制完全后進(jìn)入M期避免有絲分裂災(zāi)變(mitoticcatastrophe)的發(fā)生，而這個進(jìn)程的調(diào)控通路中，Cdc6與ATR的相互作用尤為重要。此部分檢測NCTD是否能誘導(dǎo)DU145細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變并通過檢測ATR變化和周期的進(jìn)程，進(jìn)一步佐證NCTD能夠誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)變。

19、　　 因此在第三部分實(shí)驗(yàn)中，檢測了在NCTD作用后，即在Cdc6的量以及與染色體結(jié)合的發(fā)生障礙的情況下，ATR是否也相應(yīng)地發(fā)生了變化，同時通過細(xì)胞周期的進(jìn)程檢測NCTD是否能導(dǎo)致ATR相關(guān)的檢測點(diǎn)通路的作用失效或減弱，并且通過細(xì)胞核染色，從形態(tài)學(xué)上觀察了NCTD作用后，打破檢測點(diǎn)通路可能出現(xiàn)的有絲分裂災(zāi)變的細(xì)胞核形態(tài)。
　　 方法:1、DAPI細(xì)胞核染色，DU145細(xì)胞在NCTD處理后，用DAPI進(jìn)行核染色，在顯微鏡下觀察其核

20、象變化，并與對照組對比，統(tǒng)計(jì)分析災(zāi)變核象;2、ATR的Chromatin binding試驗(yàn):選取生長良好的DU145細(xì)胞鋪板，用不同濃度的NCTD處理后，收取細(xì)胞，分離與染色體結(jié)合蛋白和非結(jié)合蛋白，然后分別對Cdc6和ATR行western blotting試驗(yàn)，比較Cdc6和ATR在不同濃度NCTD作用下與對照組的含量變化，重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理;3、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FCM):本實(shí)驗(yàn)用羥基脲(HU)處理DU145細(xì)胞，造成DNA復(fù)制壓

21、力，以此激活A(yù)TR檢測點(diǎn)通路，在此過程中加入或者不加入NCTD，作用一段時間后，收集細(xì)胞檢測細(xì)胞周期，如果NCTD能夠使ATR檢測點(diǎn)通路失活，那么在HU和NCTD同時處理的細(xì)胞將不會受到ATR檢測點(diǎn)通路的約束，從而在DNA未完全復(fù)制或者存在DNA損傷的情況下進(jìn)入有絲分裂期（M期）。
　　 第四部分:NCTD與紫杉醇的協(xié)同抗腫瘤作用。
　　 目的:檢測NCTD與紫杉醇(PTX)的聯(lián)合作用。
　　 方法:聯(lián)合指數(shù)（C

22、I值）計(jì)算:通過MTT試驗(yàn)分別計(jì)算出不同濃度NCTD作用下對DU145細(xì)胞的抑制率，計(jì)算不同濃度紫杉醇(PTX)對DU145細(xì)胞的抑制率，再計(jì)算出NCTD與PTX按照一定比例配合（本實(shí)驗(yàn)是1∶1濃度比）聯(lián)合作用下對DU145的抑制率，最后將兩種藥物單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用的抑制率進(jìn)行整理，用Calcusyn1軟件進(jìn)行計(jì)算。CI＞1表示有藥物之間拮抗作用，CI＜1表示藥物之間有協(xié)同作用，CI=1表示藥物之間作用是相加的。
　　 結(jié)果結(jié)論:<

23、br>　　 第一部分:
　　 結(jié)果:濃度為12.5μM，25μM，50μM，100μM，200μM，400μM，800μM的NCTD作用DU145細(xì)胞48h后，對細(xì)胞的抑制率（均數(shù)）分別是0.122，0.144，0.251，0.290，0.587，0.697，0.735;50％的抑制濃度約為200μM。NCTD對DU145細(xì)胞生長有強(qiáng)烈的抑制作用，并且隨著NCTD濃度的升高抑制效果更明顯。
　　 結(jié)論:NCTD對DU1

24、45細(xì)胞的有呈劑量依賴的抑制作用，其50％抑制濃度約為200μM。
　　 第二部分:
　　 結(jié)果:1、NCTD處理組BrdU陽性所占比例為30％，而對照組的BrdU陽性所占比例約為47％;2、q-PCR結(jié)果顯示NCTD處理后Cdc6、Mcm2、Mcm6mRNA水平相對于對照組無顯著性差異; Mcm3各濃度NCTD處理與對照組相比無顯著性差異（圖3-3A、B）;Cdc6、Mcm6的蛋白含量處理組相比對照組減少，并且這種差異

25、隨著濃度的升高而加大（圖3-3A、B）3、Cdc6與染色體結(jié)合的量，在同步化釋放后3h和6h后，處理組比對照組明顯減少（圖3-4A，B）;Mcm2與染色體結(jié)合量，在6h時相對于對照組明顯減少(圖3-4A，C); Mcm6與染色體結(jié)合量在0h、6h相對于對照組有明顯減少(圖3-4A，D)結(jié)論:1、NCTD能夠抑制DU145細(xì)胞的DNA合成;2、NCTD在蛋白水平而非基因減少Pre-RC（前復(fù)制復(fù)合體）中的組分Cdc6、Mcm6含量;3、在

26、細(xì)胞周期的G1期，NCTD能夠阻礙Pre-RC的組裝，即抑制Cdc6、Mcm2、Mcm6與染色體的結(jié)合。
　　 第三部分:
　　 結(jié)果:1、NCTD處理后，DU145細(xì)胞出現(xiàn)了有絲分裂災(zāi)變（圖4-1A）;0μM、50μM、100μM的NCTD處理DU145出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)變的比例分別是:3％，10％，18％（圖4-1B），p＜0.05;2、Cdc6的chromatin binding成分和非染色體結(jié)合部分都隨著NCTD濃度

27、的增大而減少，NCTD處理組與對照組對比有顯著差異，p＜0.05（圖4-2A，B）;對照組中ATR基本沒有結(jié)合到染色體上（圖4-2A，C）;NCTD處理組的染色體上結(jié)合了ATR，且ATR與染色體結(jié)合的量隨著NCTD濃度的升高而降低（圖4-2A，C），p＜0.05;3、結(jié)果如圖4-3所示:1、HU組;S期:31.1％，G2/M期:0％，HU導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷或復(fù)制不全，激活了檢測點(diǎn)通路，使細(xì)胞不能進(jìn)入G2/M期;2、HU-NCTD組:S期

28、:23.53％，G2/M期:26.11％，這說明雖然HU導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷或復(fù)制不全，激活了檢測點(diǎn)通路，但是NCTD打破了ATR相關(guān)的檢測點(diǎn)通路的束縛，細(xì)胞仍然異常第進(jìn)入G2/M期，從而產(chǎn)生異常的有絲分裂，即有絲分裂災(zāi)變。
　　 結(jié)論:1、NCTD能夠誘導(dǎo)DU145發(fā)生有絲分裂災(zāi)變（圖4-1）;2、在對照組中ATR未能結(jié)合到染色體上，說明ATR的激活需要再DNA受到損傷和復(fù)制壓力的情況下才會結(jié)合到染色體發(fā)揮其功能（圖4-2）;而

29、隨著NCTD濃度的增大，ATR與染色體結(jié)合到染色體就越少，說明NCTD能夠阻礙ATR與染色體的結(jié)合（圖4-2），從而阻礙了ATR相關(guān)的檢測點(diǎn)通路;對ATR與染色體結(jié)合的阻斷，可能是由于NCTD抑制Cdc6的功能從而無法使ATR結(jié)合到染色體上，也可能是NCTD直接對ATR的影響。而NCTD對Cdc6、ATR的影響成為NCTD能夠誘導(dǎo)DU145有絲分裂災(zāi)變的佐證;3、在HU-NCTD組中相對于HU組，S期的細(xì)胞較少，而進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞顯