肌肌醇加氧酶在糖尿病腎病中的表達(dá)變化及其與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系.pdf

1、目的探討肌肌醇加氧酶(MIOX)在糖尿病腎臟病變過程中表達(dá)的變化及其在腎小管間質(zhì)纖維化形成中的作用。 方法:(1)在體內(nèi)，應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)SD大鼠建立糖尿病(DM)大鼠模型，隨機(jī)分為DM組和糖尿病腎病(DN)組，并設(shè)正常組作為對照，分別觀察4周(DM組)和12周(DN組)，測定血尿素氮、肌酐、血糖和24 h尿微量白蛋白、尿肌酐。取大鼠的腎皮質(zhì)，病理切片染色觀察腎小管間質(zhì)的變化。提取腎皮質(zhì)組織總RNA和蛋白，Real-

2、time RT-PCR比較正常SD大鼠、DM大鼠和DN大鼠腎皮質(zhì)MIOX mRNA表達(dá)的變化；分別用RT-PCR和Western blot檢測α-SMA、E-cadherin、fibronectin mRNA和α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的改變。 (2)在體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，分別在不同時間和用不同濃度的高糖刺激NRK-52E細(xì)胞，并設(shè)正常細(xì)胞組和甘露醇組作為對照，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，RT-PCR檢測

3、MIOX、α-SMA、E-cadherin、fibronectin mRNA表達(dá)的變化；Western blot檢測α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的改變。(3)構(gòu)建MIOX基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MIOX，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，RT-PCR和Western blot分別比較轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MIOX、空載質(zhì)粒pcDNA3.1的NRK-52E細(xì)胞與正常NRK-52E細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin

4、、fibronectin mRNA和α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的變化；設(shè)計針對MIOX基因的反義寡脫氧核苷酸(anti-sense oligodeoxynucleotide，ASODN)和正義ODN(SODN)，分別轉(zhuǎn)染正常NRK-52E細(xì)胞，8h后再用高糖刺激，并與高糖刺激的正常NRK-52E細(xì)胞相比，RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染ASODN、轉(zhuǎn)染SODN的NRK-52E細(xì)胞α-SMA、E-cadheri

5、n、fibronectinmRNA和α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的改變。 結(jié)果:(1)與正常對照相比，DM大鼠尿微量白蛋白、血肌酐開始升高，而DN大鼠升高更明顯；腎臟病理切片Masson染色顯示，DN大鼠已出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化的改變；Real-time RT-PC發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，DM大鼠腎皮質(zhì)中MIOXmRNA表達(dá)增高，DN大鼠升高更明顯；與正常對照相比，DM大鼠、DN大鼠腎皮質(zhì)中α-SMA mRNA和蛋白、f

6、ibronectin mRNA的表達(dá)增加、E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)減少，差異均具有顯著性(P值均<0.01)。(2)與正常NRK-52E細(xì)胞組和甘露醇對照組相比，高糖呈時間和濃度依賴性刺激NRK-52E細(xì)胞的MIOX mRNA、α-SMA mRNA和蛋白、fibronectin mRNA的表達(dá)增加；E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)減少。差異均具有顯著性(P值均<0.05)。(3)與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和正常細(xì)胞相比，

7、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-M10x的NRK-52E細(xì)胞α-SMA mRNA和蛋白、fibronectin mRNA的表達(dá)增加； E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)減少。差異均具有顯著性(P值均<0.05)。轉(zhuǎn)染ASODN能明顯抑制正常NRK-52E細(xì)胞高糖刺激后MIOX蛋白的表達(dá)；與轉(zhuǎn)染SODN細(xì)胞和高糖刺激的正常細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ASODN的NRK-52E細(xì)胞高糖刺激后α-SMA mRNA和蛋白、fibronectin mRN