ANGPTL4在糖尿病腎病中的作用及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　糖尿病腎病以早期持續(xù)增加的微量白蛋白尿和晚期進行性腎小球濾過率（GFR）的下降為主要特征。研究發(fā)現(xiàn)控制蛋白尿的排泄與腎臟的預后有著緊密的聯(lián)系，而足細胞損傷在糖尿病患者蛋白尿發(fā)生中起到重要作用。因而，以足細胞為研究對象進行糖尿病腎病研究具有特殊意義。血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-like protein，ANGPTL4）是隸屬于血管生成調(diào)節(jié)蛋白超家族的一種分泌蛋白，在氧化代謝、血管發(fā)生、細胞分化及腫瘤

2、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在足細胞相關(guān)腎病中，腎小球足細胞分泌的ANGPTL4增加；此外，ANGPTL4轉(zhuǎn)基因大鼠表現(xiàn)為足細胞受損并且產(chǎn)生蛋白尿，提示ANGPTL4可以誘導機體發(fā)生腎小球病變并且導致蛋白尿。然而，ANGPTL4對足細胞的具體損傷表現(xiàn)及其進一步導致蛋白尿的具體機制尚不清楚。本研究擬通過動物實驗和細胞基礎實驗探討，在高糖情況下，ANGPTL4對足細胞細胞骨架及其功能調(diào)控中的作用及可能的調(diào)控機制，并為以ANGPT

3、L4為靶點，研究糖尿病腎病預防和治療的有效途徑和新的藥物靶點提供理論和實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　動物實驗：STZ尾靜脈注射誘導2型糖尿病大鼠模型，12周時選取正常對照組大鼠（10只），DM組大鼠（5只），檢測血糖、24小時尿微量白蛋白，并進行組織形態(tài)學觀察高糖下腎小球病理學改變，免疫熒光染色觀察ANGPTL4在腎小球中的定位，western blotting檢測腎臟ANGPTL4及相關(guān)蛋白表達改變。
　　細胞實驗

4、：(1)足細胞同步化后分成：正常糖濃度組（5.6 mmo l/L葡萄糖），高糖濃度組（30 mmo l/L葡萄糖），繼續(xù)觀察培養(yǎng)48 h后，應用鬼筆環(huán)肽染色標記細胞骨架，觀察高葡萄糖濃度對人足細胞細胞細胞骨架的影響。并且收集蛋白及RNA，qPCR檢測足細胞ANGPTL4表達改變，western blotting檢測人足細胞 ANGPTL4及相關(guān)蛋白表達改變。(2)高糖刺激時間梯度，檢測高糖狀態(tài)下人足細胞系ANGPTL4蛋白表達及分泌隨時

5、間的變化。（3）應用人重組ANGPTL4蛋白對足細胞進行孵育，PI/Hoechst及caspase3檢測選取ANGPTL4適宜濃度。足細胞同步化后予以對照抗體及ANGPTL4或整合素α3β1中和抗體處理2h后，予以人Angptl4重組蛋白100ng/ml，Western blotting檢測ANGPTL4、caspase3蛋白表達改變，鬼筆環(huán)肽染色觀察 ANGPTL4蛋白對人足細胞細胞細胞骨架的影響。
　　研究結(jié)果：
　　動

6、物實驗
　?。?）SD大鼠一般資料顯示，糖尿病組的血糖、24小時尿白蛋白均較對照組顯著增加（P＜0.001），腎重/體重也明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。（2）HE染色結(jié)果顯示，2型糖尿病腎病大鼠腎小球體積增大，系膜細胞及基質(zhì)增生，腎小球毛細血管袢呈分葉狀。免疫組化顯示，糖尿病組大鼠腎小球的纖維連接蛋白表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。電鏡顯示糖尿病組大鼠腎小球足突排列較為紊亂，有足突

7、融合或者足突脫落現(xiàn)象，與正常對照組大鼠相比較，其腎小球基底膜顯著性的增厚（P＜0.05）。
　?。?）免疫熒光染色顯示糖尿病組腎小球區(qū)域WT-1及Syna ptopodin的熒光強度較正常對照組顯著降低。在糖尿病組腎小球WT-1陽性細胞較對照組明顯減少，Synaptopodin陽性區(qū)域缺損，提示足細胞受到損傷。
　　（4）免疫熒光染色顯示ANGPTL4在腎小球足細胞中有表達，糖尿病組大鼠腎小球ANGPTL4熒光強度較正常對照

8、組顯著升高（P<0.05）。Western blotting檢測顯示，與對照組相比較，糖尿病大鼠腎臟ANGPTL4蛋白表達明顯增加（P<0.05），F(xiàn)AK、MAPK激活。
　　細胞實驗
　?。?）人足細胞在30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48h后，可見細胞內(nèi)ANGPTL4 mRNA表達增加（P<0.05），ANGPTL4蛋白表達下降（P<0.05），足細胞凋亡增加、細胞骨架受損。
　?。?）高糖分別刺激足細胞6h、12h、2

9、4h、48h和72h，在24h內(nèi)，足細胞表達ANGPTL4蛋白隨著刺激時間延長而增加（P<0.05），當刺激時間大于24h時，足細胞內(nèi)檢測到的ANGPTL4蛋白含量明顯降低（P<0.05），此時足細胞分泌的ANGPTL4明顯增加（P<0.05）。
　?。?）人重組ANGPTL4蛋白0、10、50、100和1000ng/ml孵育人足細胞，隨ANGPTL4蛋白濃度增加，足細胞凋亡百分比增加（P<0.05），凋亡蛋白 active ca

10、spase3/pro-caspase3比值增加（P〈0.05）。人重組ANGPTL4蛋白100ng/ml時，對足細胞的作用與葡萄糖30mmol/L相當。
　?。?）采用ANGPTL4中和抗體可以降低active caspase3/pro-caspase3比值，改善高糖導致的足細胞細胞骨架損傷（P〈0.05）；采用整合素α3β1中和抗體可以降低active caspase3/pro-caspase3比值，改善人重組ANGPTL4蛋白

11、導致的足細胞細胞骨架損傷（P〈0.05）。
　　研究結(jié)論：
　?。?）糖尿病大鼠腎臟存在足細胞損傷，ANGPTL4表達上調(diào)；高糖狀態(tài)下，足細胞ANGPTL4表達上調(diào)，足細胞細胞骨架受損，足細胞凋亡增加。
　?。?）高糖通過ANGPTL4發(fā)揮致足細胞細胞骨架損傷及足細胞凋亡的作用。
　?。?）ANGPTL4通過整合素與足細胞發(fā)揮作用。以ANGPTL4和整合素α3β1中和抗體可以拮抗高糖對足細胞的作用，可以以此為靶點