ANGPTL4在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　急性肺損傷（acute lung injury, ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratorydistress syndrome）是由炎癥失控所致的臨床危重癥疾病，表現(xiàn)為急性呼吸窘迫，低氧血癥和非心源性肺水腫。近年來雖然在氣道管理和保護(hù)性機(jī)械通氣策略等方面有了長足的進(jìn)步，但因為其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，ARDS患者的死亡率仍然居高不下。
　　由中性粒細(xì)胞過度激活導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是參與ARDS

2、肺部炎癥損傷發(fā)生發(fā)展的重要事件。研究證實脂多糖(LPS)不僅能夠氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)，還能夠通過激活NADPH氧化酶產(chǎn)生氧自由基誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)生，因此明確LPS誘導(dǎo)炎癥損傷的發(fā)病機(jī)制對于治療急性肺損傷具有重要意義。血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)，又稱為禁食誘導(dǎo)的脂肪因子，參與LPS誘導(dǎo)的肝臟以及脂肪組織中的炎癥反應(yīng)。我們前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)LPS腹腔注射后，小鼠肺組織中Angptl4的表達(dá)明顯增加，但其在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的確切作用

3、尚不明確。鑒于此，本課題擬通過構(gòu)建帶有目的基因干擾片段的慢病毒下調(diào)Angptl4在肺內(nèi)的表達(dá)，明確Angptl4在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中的作用;通過構(gòu)建干擾質(zhì)粒下調(diào)Angptl4在人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞的表達(dá)，探討Angptl4調(diào)控LPS誘導(dǎo)炎癥損傷的可能機(jī)制，并為急性肺損傷的防治提供新的作用靶點。
　　研究方法：
　　(1) ANGPTL4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建
　　根據(jù)小鼠源性murine A

4、NGPTL4(mANGPTL4)基因設(shè)計siRNA靶點，合成含有ANGPTL4干擾序列的單鏈DNA oligo，然后退火以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈，經(jīng)過酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建GV118-mANGPTL4 RNAi慢病毒載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR擴(kuò)增、測序驗證以及測序結(jié)果比對確認(rèn)構(gòu)建含有ANGPTL4小干擾RNA片段（Angptl4-siRNA，簡稱為AngsiRNA）的RNAi慢病毒載體;利用pHelper1.0

5、以及pHelper2.0輔助載體將AngsiRNA慢病毒載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，收獲病毒并利用孔稀釋法對慢病毒AngsiRNA的質(zhì)量和滴度進(jìn)行測定;建立AngsiRNA體內(nèi)感染模型，采用免疫組化、熒光定量PCR、Western blot和肺組織病理切片染色等方法，檢測AngsiRNA在肺內(nèi)的干擾效率以及對小鼠肺部病理改變的影響。
　　(2)觀察Angptl4的下調(diào)表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用
　　用經(jīng)鼻滴注的

6、方法，以4×107PFU/只的劑量建立小鼠慢病毒AngsiRNA感染模型，同時用空病毒載體NCsiRNA作為陰性對照。體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，腹腔注射LPS(15mg/kg)以建立急性肺損傷小鼠模型。采用熒光定量PCR、Western blot、免疫組化等方法檢測慢病毒AngsiRNA在體內(nèi)的干擾效率;通過比較中性粒細(xì)胞在小鼠肺內(nèi)浸潤程度以及炎癥因子表達(dá)差異來評估肺部炎癥變化情況;采用肺組織濕干比、肺泡灌洗液蛋白濃度等指標(biāo)來評估通透性改變情況

7、;通過比較cleaved-caspase3在各處理小鼠肺組織的表達(dá)差異來評估損傷改變情況;同時通過觀察小鼠7天存活率來評估Angptl4的下調(diào)表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。此外，用熒光定量PCR、Western blot方法檢測SIRT1和NF-kB表達(dá)變化情況;用脂質(zhì)氧化(MDA)檢測各處理小鼠肺組織MDA含量，以探討Angptl4的下調(diào)表達(dá)保護(hù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的可能機(jī)制。
　　(3)以人肺泡上皮細(xì)胞株A

8、549細(xì)胞為模型探討Angptl4在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用機(jī)制
　　用Western blot的方法比較A549細(xì)胞中，Angptl4在LPS刺激后各個時間點的表達(dá)變化;構(gòu)建質(zhì)粒，用RNA干擾的方法下調(diào)Angptl4在A549細(xì)胞中的表達(dá)，觀察Angptl4對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷以及信號通路分子SIRT1表達(dá)的影響;采用siRNA干擾技術(shù)和SIRT1拮抗劑尼克酰胺(NAM)同時下調(diào)Angptl4和SIRT1在A549細(xì)

9、胞的表達(dá)后，通過觀察炎癥因子IL6和NF-kB表達(dá)變化情況進(jìn)一步明確SIRT1信號通路在Angptl4調(diào)控LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建了具有干擾目的基因作用的AngsiRNA慢病毒和對照空病毒NCsiRNA，感染滴度分別為:1×109 PFU/mL，2×109pFU/mL，符合實驗要求;熒光定量PCR、Western blot、免疫組化結(jié)果證實慢病毒AngsiRNA經(jīng)鼻滴入后能夠顯著下調(diào)A

10、ngptl4在肺組織中的表達(dá)(P＜0.05)，并且不會引起小鼠肺組織發(fā)生明顯的病理變化。
　　(2) Angptl4表達(dá)于正常小鼠肺組織，主要分布于肺泡上皮細(xì)胞。LPS腹腔注射后，小鼠肺內(nèi)Angptl4表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05);與LPS以及NCsiRNA+LPS組相比，AngsiRNA+LPS組小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤減輕、炎癥因子TNF-α和IL6含量減少、肺濕干比和肺泡灌洗液蛋白濃度降低、肺內(nèi)MPO表達(dá)降低、活化的ca

11、spase3表達(dá)降低、肺損傷小鼠7天存活率顯著提高（P＜0.05）。
　　(3)與LPS以及NCsiRNA+LPS組相比，AngsiRNA+LPS組小鼠肺組織SIRT1表達(dá)顯著增加(P＜0.05);NF-kB表達(dá)和MDA表達(dá)含量顯著降低(P＜0.05)。
　　(4) LPS刺激后，Angptl4在A549細(xì)胞中表達(dá)上調(diào);下調(diào)Angptl4的表達(dá)能夠減輕LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNFα和IL6的釋放和A549細(xì)胞凋亡（P＜0.05

12、）;與LPS和NCsiRNA+LPS組相比，AngsiRNA+LPS組A549細(xì)胞中SIRT1表達(dá)增加。為了進(jìn)一步證實SIRT1信號通路在Angptl4調(diào)控LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，我們同時下調(diào)了Angptl4和SIRT1在A549細(xì)胞的表達(dá)，與AngsiRNA+LPS組相比，AngsiRNA+LPS+NAM組A549細(xì)胞中IL6和NF-kB表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1) LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷