PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的:前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中高表達，而PDE4B敲除后，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但PDE4B在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中可能的作用機制尚不清楚。故本研究從整體和細胞兩個水平，探討其具體作用機制。
　　方法:通過LPS2mg/kg氣道滴入誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，以PDE4B敲除小鼠和野生型C57/BL6小鼠為研究對象，研究PDE4B在急性肺損傷整體動物模型上的作用。LPS氣道滴入后6h，右側(cè)結(jié)扎

2、取肺，左側(cè)灌洗取肺泡灌洗液(BALF)，采用EILSA測定BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β相關(guān)炎癥因子的含量;采用熒光定量PCR測定了PDE4B、TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的mRNA表達水平;采用WB分析肺組織中的NF-κB、IKK信號通路蛋白。
　　采用電轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PDE4B-siRNA，沉默MHS細胞表達PDE4B。熒光定量PCR方法檢測PDE4B沉默效率。采用LPS500ng/ml分別刺激6h，

3、6h后分別收獲細胞和上清。測定指標同上。
　　采用Fugene6轉(zhuǎn)染PDE4B過表達質(zhì)粒，在MH-S細胞中過表達PDE4B，采用熒光定量PCR方法檢測PDE4B過表達效率。轉(zhuǎn)染18h后收獲細胞和上清。測定指標同上。
　　結(jié)果:在整體實驗中，野生型小鼠在LPS刺激后，白細胞總數(shù)明顯增多，并以中性粒細胞為主。炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA及其蛋白大量合成和分泌。IKK蛋白大量磷酸化，NF-κB mRNA和蛋白

4、表達也相應(yīng)增多。而PDE4B敲除小鼠相對野生型小鼠對LPS刺激不敏感。與對照組相比，敲除小鼠LPS刺激后，白細胞總數(shù)，中性粒細胞增多較少;LPS刺激引起的TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥介質(zhì)的mRNA表達和蛋白分泌明顯減少;同時IKK蛋白磷酸化減少，NF-κB mRNA和蛋白表達也相應(yīng)減少。
　　在體外實驗中，正常MHS細胞在LPS刺激后，與動物實驗相似，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達和蛋白分泌明顯增多

5、。IKK蛋白大量磷酸化,NF-κBmRNA和蛋白表達相應(yīng)增多。PDE4B-siRNA沉默MH-S細胞后，LPS刺激引起的TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達和蛋白分泌明顯減少，同時IKK蛋白磷酸化減少，NF-κB mRNA和蛋白表達也相應(yīng)減少。而PDE4B過表達的MH-S細胞相對正常細胞表現(xiàn)出類似LPS刺激反應(yīng)。炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達和蛋白分泌明顯增多，同時IKK蛋白磷酸化增多，NF-κB mRN