Notch信號(hào)在LPS引發(fā)小鼠胚胎肺損傷中作用的初步研究.pdf

1、目的:
　　 支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonarydy splasia,BPD)是發(fā)生于早產(chǎn)兒的一種常見(jiàn)慢性肺疾病。一般認(rèn)為BPD的發(fā)生是與長(zhǎng)期的機(jī)械通氣和輔助用氧有關(guān),然而越來(lái)越多的證據(jù)表明圍生期的宮內(nèi)感染(Intrauterineinfection)可能在BPD的發(fā)病中亦起著關(guān)鍵作用,宮內(nèi)感染通過(guò)影響肺泡細(xì)胞的死亡和炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮作用。
　　 目前國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染的病原體主要是革蘭陰性菌,主要致病成

2、分是其胞壁上的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。LPS可與宿主細(xì)胞表面泛特異性受體Toll樣受體4(Tolllikereceptor4,TLR4)結(jié)合,通過(guò)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活急性炎癥反應(yīng),從而在多個(gè)環(huán)節(jié)致使宿主天然免疫系統(tǒng)的失衡,導(dǎo)致宿主肺組織處于一個(gè)適度的炎性預(yù)敏狀態(tài)和肺發(fā)育的異常,在后天的因素如機(jī)械通氣、高氧等共同作用下導(dǎo)致宿主肺組織炎性反應(yīng)的增強(qiáng)并最終引起B(yǎng)PD的發(fā)生。Notch信號(hào)通路由Notch受

3、體、配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子CSL蛋白以及Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4類(lèi)Notch基因,編碼4種Notch受體,即Notch1～4。Notch受體是一種單次跨膜蛋白,其結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。Notch配體同樣為單次跨膜蛋白,在哺乳動(dòng)物中鑒別出至少5種配體:Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3及Delta4。Notch信號(hào)通路參與肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺動(dòng)脈高壓癥等多種肺部疾病的

4、病理過(guò)程,干預(yù)Notch信號(hào)有望阻抑這些疾病的發(fā)生及發(fā)展,為其預(yù)防和治療提供新思路。
　　 本研究擬使用Ⅱ型肺泡細(xì)胞(Mouse Lung Epithelial12,MLE12)和昆明小鼠E18.5肺組織為研究對(duì)象,利用LPS來(lái)建立模型,模擬宮內(nèi)感染。觀察Notch信號(hào)在LPS處理后的表達(dá)變化情況,隨后利用Notch信號(hào)抑制劑(DAPT)來(lái)研究Notch受體對(duì)Ⅱ型肺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡的作用,進(jìn)而探討Notch受體在BPD發(fā)

5、生中的可能機(jī)制,闡述Notch抑制劑在緩解炎癥反應(yīng)及增加存活率的作用,為臨床上治療BPD提供方案。
　　 方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2、體外培養(yǎng)E18.5肺切片
　　 3、RealtimePCR
　　 4、WesternBlotting
　　 5、WST
　　 6、細(xì)胞免疫熒光
　　 7、石蠟包埋及切片
　　 8、組織免疫熒光
　　 9、統(tǒng)計(jì)分析

6、r>　　 結(jié)果:
　　 1、肺發(fā)育過(guò)程中Notch表達(dá)變化情況
　　 隨著肺的發(fā)育進(jìn)程,Notch1、2的表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。
　　 2、LPS處理MLE12細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)
　　 (1)60μg/mlLPS處理24小時(shí)可能導(dǎo)致MLE12細(xì)胞凋亡和炎癥因子的大量釋放,但是10μg/mlLPS卻不能引起此效應(yīng)。
　　 (2)與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)60μg/mlLPS處理24小時(shí)引起Notch1、Notch2

7、表達(dá)水平升高,但是10μg/mlLPS卻不能引起此效應(yīng)。
　　 3、阻斷Notch信號(hào)后,LPS處理MLE12細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)
　　 (1)LPS和DAPT聯(lián)合處理MLE12細(xì)胞使Notch1、Notch2表達(dá)量下降。
　　 (2)LPS和DAPT聯(lián)合處理MLE12細(xì)胞可能抑制了LPS所引起的細(xì)胞凋亡和炎癥因子的大量釋放。
　　 4、LPS處理E18.5肺切片24小時(shí)后的生物學(xué)效應(yīng)
　　 (1)

8、60μg/mlLPS處理E18.5肺切片24小時(shí)后同樣能觀察到炎癥因子IL6及NF-κb的mRNA升高。
　　 (2)與此同時(shí),60μg/mlLPS處理E18.5n肺切片24dx時(shí)后發(fā)現(xiàn)Notch1,2的mRNA升高。
　　 5、LPS和DAPT聯(lián)合處理18.5肺切片24小時(shí)后的生物學(xué)效應(yīng)
　　 (1)LPS聯(lián)合DAPT處理E18.5肺切片24小時(shí),抑制TLPS引起的Notch2蛋白的升高。
　　 (2)