DAPK1在急性肺損傷炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床上較為常見(jiàn)的由創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染等多種內(nèi)外因素誘發(fā)的以難治性低氧血癥為特征的危重癥，目前認(rèn)為ALI/ARDS的本質(zhì)是一種炎癥，其發(fā)病與炎癥的失控密切相關(guān)。盡管近年來(lái)人們對(duì)ARDS的研究不斷深入，診療技術(shù)有明顯提升，其病死率仍居高不下[1-2]。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制，尋求新的有效的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的藥物和治療手段，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)以降低發(fā)病率和死亡率顯得尤為重要。
　　死亡相

2、關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)是一種鈣調(diào)蛋白(CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包含有多個(gè)功能區(qū)域，作為一種凋亡正性調(diào)節(jié)因子在多種途徑誘導(dǎo)引起的凋亡中扮演著重要角色[3-4]，還參與了炎癥的調(diào)節(jié)和自噬[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1參與了腦及腎的缺血性急性損傷疾病過(guò)程[7-8]。然而，DAPK1是否也參與急性肺損傷的發(fā)病過(guò)程，是否參與其炎癥失控的調(diào)節(jié)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題擬采用脂多糖(LPS)構(gòu)建急性肺損傷模型及LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞

3、炎癥模型，觀察DAPK1的表達(dá)變化，并通過(guò)下調(diào)DAPK1表達(dá)后觀察細(xì)胞自噬水平、促炎基因表達(dá)及炎癥因子表達(dá)水平，從而探討DAPK1在急性肺損傷發(fā)病及炎癥調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制。
　　目的：
　　1.明確DAPK1在急性肺損傷時(shí)的表達(dá)及其在炎癥失控中的作用;
　　2.探討DAPK1在控制炎癥反應(yīng)過(guò)程中的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　1.DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)研究
　　通過(guò)LPS(10mg/k

4、g)腹腔注射構(gòu)建急性肺損傷小鼠模型，采取HE染色觀察肺損傷病理改變情況，免疫組化、Western blot及Real-time PCR等技術(shù)明確DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)變化及定位，ELISA檢測(cè)血漿促炎因子水平變化。
　　2.DAPK1對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　Western blot及Real-time PCR技術(shù)觀察LPS作用RAW264.7巨噬細(xì)胞后，DAPK1隨時(shí)間和濃

5、度改變的表達(dá)情況;構(gòu)建DAPK1shRNA腺相關(guān)病毒，感染巨噬細(xì)胞后應(yīng)用Western blot觀察對(duì)NK-KB啟動(dòng)子活性、下游p38-mTOR信號(hào)通路、自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的影響，Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)變化。
　　3.下調(diào)DAPK1的表達(dá)對(duì)急性肺損傷炎癥反應(yīng)的影響
　　采取LPS腹腔注射構(gòu)建急性肺損傷模型，使用DAPK1特異性抑制劑TC-DAPK6預(yù)處理小鼠抑制D

6、APK1表達(dá)，Western blot檢測(cè)TC-DAPK6對(duì)DAPK1的抑制效果，HE染色觀察DAPK1抑制后對(duì)LPS誘導(dǎo)肺損傷的病理改變情況，Western blot及Real-timePCR觀察DAPK1抑制后對(duì)NF-κB P65及促炎因子水平的影響，應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析研究不同處理組小鼠的生存時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了急性肺損傷小鼠模型，DAPK1在正常小鼠肺組織中僅少量表達(dá)，在急性肺損傷3

7、h時(shí)DAPK1表達(dá)較對(duì)照組升高(P＜0.05)，至24h達(dá)到最高水平(P＜0.05)。炎癥因子TNF-α、IL-6急性肺損傷時(shí)較對(duì)照組表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，在12-24h維持在較高水平(P＜0.05)。隨著LPS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肺濕干重比逐漸升高(P＜0.05)。
　　2.隨著LPS濃度的不斷升高，刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞DAPK1表達(dá)逐漸增加(P＜0.05)。在LPS刺激6h后開(kāi)始上升(P＜0.05)，至24h達(dá)到最

8、高水平(P＜0.05)，至48h表達(dá)有所下降(P＜0.05)。此外，LPS處理RAW264.7細(xì)胞后，NF-κB啟動(dòng)子活性以及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)顯著升高。通過(guò)AAV-DAPK1shRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)巨噬細(xì)胞DAPK1表達(dá)后，NF-κB啟動(dòng)子活性明顯下降(P＜0.05)，同時(shí)P38-mTOR表達(dá)受到抑制，LC3Ⅱ/Ⅰ上調(diào)，而p62表達(dá)減少(P＜0.05)，自噬激活。此外，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)

9、水平也明顯下降(P＜0.05)。
　　3.TC-DAPK6特異性抑制DAPK1表達(dá)后，小鼠肺組織病理?yè)p傷較單獨(dú)LPS組明顯減輕，DAPK1表達(dá)受抑制后NF-κB p65表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，血漿中促炎因子TNF-α、IL-6水平明顯低于LPS組(p＜0.05)，肺濕干重比顯著降低。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，DAPK1抑制后小鼠的生存期顯著長(zhǎng)于LPS組(p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.DAP