鋅指蛋白A20對(duì)急性肺損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 A20蛋白在靜脈注射LPS所致大鼠急性肺損傷中的變化及意義
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠LPS所致急性肺損傷模型，旨在研究A20蛋白在LPS急性肺損傷的表達(dá)變化及意義。方法：實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組：正常對(duì)照組(尾靜脈注射PBS，1ml/只，定義為0h)；LPS組(尾靜脈注射LPS，10mg/kg，濃度為2mg/ml，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h分為

2、8個(gè)亞組)。所有動(dòng)物在注射LPS相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)放血處死，收集標(biāo)本，觀察光鏡(HE染色)，檢測(cè)肺濕干比(W/D)，行支氣管肺泡灌洗，檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度，BALF中有核細(xì)胞總數(shù)，BALF中TNF-α、IL-1β水平，肺組織NF-κB DNA結(jié)合活性及核蛋白p65水平，肺組織中A20蛋白及mRNA含量，A20定位。結(jié)果：與正常對(duì)照相比，注射LPS24小時(shí)后肺W/D、BALF中有核細(xì)胞總數(shù)(×104/ml)及BALF中蛋白濃

3、度(ug/ml)均明顯升高(p<0.05)，光鏡下可見(jiàn)肺泡間隔增厚，有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞滲出；注射LPS后，BALF液中TNF-α、IL-1β水平及肺組織中NF-κB DNA結(jié)合活性及核蛋白p65含量隨時(shí)間升高，于注射后2h達(dá)高峰，之后逐漸下降，但仍高于注射前，且在24h又發(fā)生一過(guò)性升高(p<0.05)；肺組織中A20蛋白及mRNA水平也逐漸升高，于注射后2h達(dá)高峰，之后下降，但仍高于注射前(p<0.05)

4、；免疫組化示A20在LPS注射后2小時(shí)主要表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞胞漿。結(jié)論：1.健康大鼠靜脈注射LPS10ml/kg24h后可出現(xiàn)急性肺損傷。2。急性肺損傷時(shí)，A20蛋白表達(dá)升高，且高峰期與ALI早期細(xì)胞因子及NF-κB活性一致。3.A20在急性肺損傷早期明顯升高，且表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞，由此推測(cè)A20可能通過(guò)調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥活性影響肺損傷。
　　 第二部分 A20對(duì)LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制
　　 目的

5、：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立A20基因沉默及過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞株研究A20對(duì)LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞炎癥活性影響，旨在探討A20對(duì)LPS所致肺損傷的作用及機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)選用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(NR8383)，慢病毒法構(gòu)建A20基因沉默及過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，Western Bblot及RT-PCR鑒定A20表達(dá)，并行體外培養(yǎng)慢病毒包裝后的A20干擾(A20-SH)、干擾空載(SCR)、過(guò)表達(dá)(A20)及過(guò)表達(dá)空載(VEC)細(xì)胞株。向培養(yǎng)基中加入LPS進(jìn)行

6、干預(yù)(1ug LPS/ml培養(yǎng)基)，于刺激后0.5、1、2、4小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-1β水平及細(xì)胞中NF-κB DNA結(jié)合活性；Western Blot法檢測(cè)A20蛋白及核內(nèi)p65含量；RT-PCR檢測(cè)A20、TNF-α、IL-1βmRNA含量。結(jié)果：構(gòu)建的A20-SH肺泡巨噬細(xì)胞株中，A20蛋白及mRNA含量較SCR明顯降低(p<0.05)，干擾效率達(dá)80％；過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞中A20

7、蛋白及mRNA含量較VEC明顯升高(p<0.05)，表達(dá)增加10倍以上。LPS刺激后，SCR組及VEC組A20蛋白及mRNA含量升高，且于1h達(dá)高峰，之后逐漸下降，而A20-SH組較SCR組明顯降低(p<0.05)，且始終維持在較低水平，A20組較VEC明顯升高(p<0.05)。LPS刺激后各組肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)mRNA及培養(yǎng)上清液中含量、肺組織中NF-κB DNA結(jié)合活性及核內(nèi)p65含量都隨時(shí)間升高，于1

8、h達(dá)高峰，之后逐漸下降；但與SCR相比，A20-SH組明顯升高(p<0.05)；與VEC組相比，A20組水平明顯降低(p<0.05)。結(jié)論：1.慢病毒RNAi表達(dá)載體及A20過(guò)表達(dá)載體可分別有效地抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株中的A20基因表達(dá)或增加該基因表達(dá)。2.A20基因沉默導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB活性升高，促進(jìn)TNF-α、IL-1β表達(dá)及分泌；反之A20基因過(guò)表達(dá)能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表達(dá)和分泌。3.