鋅指蛋白A20保護(hù)大鼠肝移植急性排斥模型中供肝內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的①構(gòu)建鋅指蛋白A20重組腺病毒。②通過同種異體肝移植急生排斥模型(Wistar→SD大鼠)受體大鼠靜脈注射A20腺病毒或?qū)φ障俨《?，觀察鋅指蛋白A20對(duì)同種異體肝移植免疫排斥的抑制作用及其機(jī)制。試圖闡明鋅指蛋白A20對(duì)同種異體移植肝的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法①?gòu)臄y帶有全長(zhǎng)小鼠A20cDNA的質(zhì)粒pCAGGS-FLAG-A20獲得A20NcoⅠ→SalⅠ2332bp的基因片段，將其克隆到腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pA

2、dTrack-CMV上，與骨架質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進(jìn)行同源重組，經(jīng)293細(xì)胞包裝生成攜帶A20基因片段的重組腺病毒rAdEasy-A20，同法生成對(duì)照空腺病毒rAdEasy。②參照“二袖套法”建立Wistar→SD大鼠同種異體肝移植動(dòng)物模型，將供、受體大鼠隨機(jī)分為3組：?jiǎn)渭兏我浦步M、肝移植對(duì)照腺病毒治療組、肝移植A20腺病毒治療組，供體大鼠于術(shù)前24h經(jīng)陰莖靜脈注射5×109pfuA20腺病毒或5×109pfu對(duì)照空病毒或同體積

3、生理鹽水。術(shù)后第7天或?yàn)l死前處死部分受體鼠取肝和血液等標(biāo)本，HE染色觀察移植肝組織免疫排斥病理變化，全自動(dòng)生化分析法檢測(cè)肝功能變化，免疫組化檢測(cè)移植肝組織VCAM-1表達(dá)變化，TUNEL法檢測(cè)移植肝肝細(xì)胞凋亡情況；觀察受體大鼠存活時(shí)間。通過以上實(shí)驗(yàn)觀察A20對(duì)同種異體肝移植免疫排斥的影響并探討其作用機(jī)制。 結(jié)果①小鼠A20基因NcoⅠ→SalⅠ(2332bp)片段與腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)在BJ5183細(xì)菌內(nèi)通過同源重組法制備

4、出A20重組腺病毒(rAdEasy-A20)。免疫組化檢測(cè)顯示rAdEasy-A20感染之293細(xì)胞高水平表達(dá)A20mRNA和A20蛋白，而正常293細(xì)胞及rAdEasy感染之293細(xì)胞不表達(dá)A20mRNA和A20蛋白。②Wistar大鼠→SD大鼠肝移植后第7天內(nèi)已發(fā)生典型急性排斥反應(yīng)，移植肝組織切片呈現(xiàn)中、重度排斥病理改變，肝功能損害明顯，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素含量明顯升高，白蛋白含量降低，在無(wú)任何干預(yù)治療情況下受體大鼠于術(shù)后5～2

5、0天死亡。A20腺病毒治療組受體大鼠術(shù)后第7天僅有1/5例移植肝呈現(xiàn)1級(jí)急性排斥反應(yīng)，輕于單純肝移植組及對(duì)照腺病毒治療組，受體大鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)，術(shù)后存活11～33天，明顯長(zhǎng)于單純肝移植組及對(duì)照腺病毒治療組(存活5～15天)(P＜0.001)；免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示肝移植A20腺病毒治療組移植肝VCAM-1表達(dá)水平均較肝移植對(duì)照組和肝移植對(duì)照腺病毒治療組明顯降低；TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示肝移植A20腺病毒治療組移植肝肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(4.34±