血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制初探.pdf

1、目的:
　　 1、建立DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應(yīng)模型,觀察DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植后移植肝臟能否產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。監(jiān)測(cè)受者大鼠生存及生化或血清學(xué)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)移植肝功能,排斥由組織學(xué)確定。2、后用免疫組化法分別檢測(cè)VEGF、CD68(+)macrophages、CD3(+)T cells；用RT—PCR法分別檢測(cè)VEGF、IP-10在模型各亞組受體中用藥前后肝

2、臟及脾臟組織中的表達(dá)；用ELISA方法分別檢測(cè)用藥前后VEGF在其血清中的水平,以了解VEGF的表達(dá)或水平狀況是否與炎性細(xì)胞浸潤(rùn),新生血管生成,T細(xì)胞,移植物存活時(shí)間有關(guān)系及關(guān)系如何。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),試圖初步探索VEGF在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、近交系DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝臟移植急性排斥反應(yīng)模型的建立。采用經(jīng)典的由Ka(m)ada和Calne等開(kāi)創(chuàng)的二袖套法

3、進(jìn)行大鼠原位肝移植,具體步驟可參見(jiàn)其論文(Surgery1983 Jan;93:64—9)。實(shí)驗(yàn)分二組:(1)、DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠間移植為同種異體移植急性排斥組(acute allograft rejectionOLT,OLTa,n=40)；LEW(RT11)-DA(RT1a)大鼠間移植為同系移植耐受對(duì)照組(syngeneic OLT,OLTs,n=40)；(2)、兩組各取10只觀察存活,按移植術(shù)后1,3,7天分亞

4、組,每個(gè)亞組10只大鼠作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。通過(guò)監(jiān)測(cè)受者大鼠生存及生化或血清學(xué)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)移植肝功能,排斥由組織學(xué)確定。
　　 2、VEGF在受體血清中的水平測(cè)定。將大鼠DA(RT1a)-LEW(RT11)同種異體移植急性排斥反應(yīng)模型對(duì)受體用藥的不同分為二組,每個(gè)組40只大鼠:分別為A.實(shí)驗(yàn)組:VEGF單克隆抗體,經(jīng)腹腔注入受體大鼠體內(nèi)。B.對(duì)照組:不用藥。根據(jù)移植后時(shí)間的不同,上述實(shí)驗(yàn)組又各分為移植術(shù)后1,3,7天亞組,每個(gè)亞組10只

5、大鼠。各亞組受體大鼠于術(shù)后按上述預(yù)定的1,3,7天數(shù)殺死,分別從下腔靜脈取血2ml,用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各亞組受體大鼠血清中VEGF的水平。
　　 3、分組同“2”。免疫組化法分別檢測(cè)VEGF、CD68(+)macrophages、CD3(+)Tcells等各種指標(biāo)在模型各亞組受體中用藥前后肝臟,脾臟中的表達(dá),目的是為了研究未阻斷VEGF的作用及阻斷VEGF的作用以后在肝臟中VEGF的表達(dá)分別和巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、新生血管

6、、炎性介質(zhì)之間是否有關(guān)系及關(guān)系如何,從而初步揭示VEGF是通過(guò)介導(dǎo)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管新生的相互作用,而不是通過(guò)作用于T細(xì)胞而在肝移植急性排斥反應(yīng)中起著促進(jìn)作用。
　　 4、分組同“2”。用RT—PCR方法分別檢測(cè)VEGF、IP-10等各種指標(biāo)在模型各亞組受體中用藥前后肝臟中的表達(dá),目的是為了進(jìn)一步從分子基因水平研究未阻斷VEGF的作用及阻斷VEGF的作用以后在肝臟中VEGF的表達(dá)分別和各炎性細(xì)胞及介質(zhì)之間的相互關(guān)系如何,從

7、而進(jìn)一步揭示匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管新生的互動(dòng)和時(shí)間上的重疊才是導(dǎo)致肝移植后急性排斥反應(yīng)的主要機(jī)制,為原位肝移植急性排斥反應(yīng)機(jī)理提出新的理論解釋。
　　 結(jié)果:
　　 1、DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型,肝組織病理改變明顯,表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性嚴(yán)重,有部分灶狀及橋狀壞死,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯,肝竇顯著充血,明顯擴(kuò)張,匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)小靜脈、終末肝靜脈及中央靜脈內(nèi)皮下淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),

8、膽管上皮細(xì)胞腫脹,結(jié)構(gòu)破壞,變性壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰。肝臟功能損害進(jìn)行性加重,1周存活率為30％,達(dá)到Banff急性排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的中、重度水平。而在未使用免疫抑制劑的情況下,LEW(RT11)-DA(RT1a)大鼠原位肝移植后可產(chǎn)生免疫耐受,其1周存活率為70％,病理檢查顯示:肝組織形態(tài)改變輕微,肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞部分變性腫脹,個(gè)別肝細(xì)胞壞死,匯管區(qū)輕度擴(kuò)張及伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝竇輕度充血并伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),整個(gè)肝小葉結(jié)構(gòu)

9、基本正常。肝功能損害較輕,7天左右基本恢復(fù)到正常。2、在實(shí)驗(yàn)組,肝臟、脾臟組織VEGF、CD68(+)macrophages、IP-10的表達(dá)及血漿VEGF水平檢測(cè)均較對(duì)照組為低(P<0.05),而CD3(+)T cells在兩組中的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3、VEGF表達(dá)與受體鼠的存活時(shí)間成反比。初步提示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是通過(guò)介導(dǎo)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管新生的相互作用而在肝移植急性排斥反應(yīng)中起著促進(jìn)作用。