血管內(nèi)皮生長因子-C在大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙中的作用及機制研究.pdf

1、大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(MCD)是藥物難治性癲癇的重要病因之一。隨著高清影像學(xué)技術(shù)的普及,MCD的臨床檢出率不斷提高,現(xiàn)已證實約有40％的藥物難治性癲癇是由MCD所致,而在小于3歲的兒童藥物難治性癲癇病人中更高達(dá)80％,因此MCD已成為藥物難治性癲癇研究領(lǐng)域內(nèi)重點和熱點的問題。MCD是一類病理學(xué)表現(xiàn)類似疾病的總稱,主要包括結(jié)節(jié)性硬化(TSC)、局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(FCD)、多小腦回、無腦回畸形及Sturge-Weber綜合征等亞型,其中TSC

2、和FCD是最常見的MCD亞型。盡管MCD根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)具有不同的分類,但都具有共同的組織病理學(xué)特點,表現(xiàn)為大腦皮層層狀結(jié)構(gòu)和柱狀結(jié)構(gòu)紊亂、腦回結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)大量異形神經(jīng)元(DNs)、巨形神經(jīng)元(GNs)、氣球樣細(xì)胞(BCs)以及巨細(xì)胞(GCs)等,這些異常的細(xì)胞被稱作異構(gòu)神經(jīng)元(MNs)。臨床資料表明伴有異構(gòu)神經(jīng)元的MCD患者更易出現(xiàn)癲癇發(fā)作,早期出現(xiàn)耐藥。因此,異構(gòu)神經(jīng)元在MCD的致癇性中發(fā)揮“核心作用”。目前,對異構(gòu)神經(jīng)元的病理

3、發(fā)生機制尚無明確定論,較為公認(rèn)的觀點認(rèn)為,異構(gòu)神經(jīng)元的產(chǎn)生可能是由胚胎發(fā)育期間神經(jīng)元遷移,成熟和/或細(xì)胞死亡過程中出現(xiàn)異常所致。此外,圍產(chǎn)期和出生后早期的腦損傷可能也參與了異構(gòu)神經(jīng)元的病理發(fā)生?？傊?目前對MCD及異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生機制所知有限,對涉及其中的關(guān)鍵因子、信號途徑仍待闡明。
　　 VEGF-C是公認(rèn)的淋巴系統(tǒng)發(fā)生調(diào)節(jié)因子,通過激活兩個特異性受體VEGFR-2,VEGFR-3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),其中VEGFR-3為VEGF

4、-C的主力型受體。在正常情況下,VEGF-C及VEGFR-3局限性表達(dá)于淋巴內(nèi)皮,而它的另一受體VEGFR-2則在血管內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮上均有表達(dá),發(fā)揮其促脈管系統(tǒng)發(fā)生的作用。
　　 由于腦內(nèi)淋巴系統(tǒng)缺如,既往很少有研究關(guān)注VEGF-C在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。直到2006年,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠敲除VEGF-C后,表達(dá)VEGFR-3受體的神經(jīng)的體細(xì)胞增殖明顯受阻,而且胚胎視神經(jīng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞選擇性缺失,證明VEGF-C信號通路參與

5、了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能。近兩年來陸續(xù)有研究揭示了VEGF-C信號系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)中的新作用,如VEGF-C/VEGFR-3能夠介導(dǎo)膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖,遷移。新近報道腦缺血后,定位于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層最內(nèi)側(cè)帶的細(xì)胞高度表達(dá)vEGFR-3,這些細(xì)胞同時表達(dá)與細(xì)胞遷移相關(guān)的神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物PSA-NCAM,表明VEGF-C系統(tǒng)參與腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生。此外,腦卒中后,患側(cè)SVZ區(qū)內(nèi)VEGFR-3的表達(dá)水平顯著上調(diào),表型鑒

6、定實驗證實絕大多數(shù)表達(dá)VEGFR-3的細(xì)胞主要為具有旺盛增殖活力的神經(jīng)祖細(xì)胞,另有小部分VEGFR-3陽性細(xì)胞為具備遷徙能力的神經(jīng)前體細(xì)胞。在本研究預(yù)實驗中,我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除的MCD標(biāo)本中VEGF-CmRNA表達(dá)上調(diào)。那么,VEGF-C及其受體在MCD中的具體表達(dá)模式如何?是否表達(dá)于異構(gòu)神經(jīng)元?高表達(dá)的VEGF-C是否參與MCD所致癲癇發(fā)作?這些問題值得我們關(guān)注。
　　 為了闡明VEGF-C在MCD中的作用及其可能的機制,首先,

7、我們利用半定量RT-PCR、western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了VEGF-C及其受體在MCD(TSC與FCD亞型)臨床標(biāo)本中的表達(dá)分布情況;其次,觀測了VEGF-C受體信號通路下游相關(guān)信號分子的表達(dá)活化情況;第三,觀察了與VEGF-C高度同源的VEGF-D在MCD中的表達(dá)情況;最后,為了直觀的了解VEGF-C對MCD致癇效應(yīng)的影響,我們建立MCD大鼠模型,利用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù),觀察VEGF-C對MCD大鼠異構(gòu)神經(jīng)元興奮性

8、谷氨酸受體(NMDA受體)的調(diào)節(jié)效應(yīng)。通過這些研究,我們得到以下結(jié)果:
　　 一、VEGF-C及其受體在MCD中的表達(dá)分布
　　 1.通過RT-PCR,western blot分析,從基因和蛋白水平證明正常皮層中不同程度地表達(dá)VEGF-C、VEGFR-2及VEGFR-3;免疫組化結(jié)果表明VEGF-C及其受體主要分布于皮層錐體神經(jīng)元:
　　 2.在TSC皮層結(jié)節(jié)組織勻漿中,VEGF-C及其受體VEGFR-2、VEG

9、FR-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常對照組明顯升高。免疫組化結(jié)果顯示,VEGF-C,VEGFR-2及VEGFR-3特征性的高表達(dá)于DNs、GCs及反應(yīng)型膠質(zhì)細(xì)胞;免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明:①絕大多數(shù)VEGF-C免疫陽性的DNs,GCs共表達(dá)神經(jīng)絲蛋白標(biāo)記物NF-200;然而未見共表達(dá)與另一種神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP共表達(dá);TSC組織中可見CD68陽性的巨噬細(xì)胞浸潤,但是這些細(xì)胞不表達(dá)VEGF-C;②VEGF

10、R-2與VEGFR-3的細(xì)胞定位表達(dá)模式類似,多數(shù)VEGFR-2或VEGFR-3免疫陽性的DNs與NF-200共表達(dá),而共表達(dá)VEGFR-2(VEGFR-3)與NF-200的GCs略少,未見VEGFR-2(VEGFR-3)免疫陽性的DNs,GCs共表達(dá)GFAP。
　　 3.在另一常見的MCD亞型-FCD中,VEGF-C及受體VEGFR-2、VEGFR-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常對照組同樣顯著升高。VEGF-C及其受體高表達(dá)

11、于DNs,GNs,BCs及膠質(zhì)細(xì)胞。免疫雙標(biāo)結(jié)果顯示:①VEGF-c免疫陽性的異構(gòu)神經(jīng)元不表達(dá)GFAP;與TSC中表達(dá)模式不同的是,FCD中的DNs,GNs,BCs能夠同時表達(dá)VEGF-C與NeuN,提示其具有成熟神經(jīng)元屬性。②VEGFR-3免疫陽性的異構(gòu)神經(jīng)元既不表達(dá)NF-200,又不表達(dá)GFAP,表明其特殊的分子表型。
　　 二、MCD病灶內(nèi)VEGF-C下游相關(guān)信號通路的表達(dá)活化
　　 1.RT-PCR結(jié)果表明,MC

12、D中Akt的基因表達(dá)上調(diào);利用western blot觀察Akt蛋白亞型表達(dá),發(fā)現(xiàn)三種Akt亞型的表達(dá)均上調(diào),其中Akt-1的表達(dá)上調(diào)最為明顯,表明Akt信號通路參與了MCD的病理生理機制。
　　 2.正常皮層及MCD中均可見Bad的表達(dá),且表達(dá)水平基本相同;然而,MCD病灶內(nèi)的磷酸化Bad(p-Bad)表達(dá)顯著升高,提示MCD中抗凋亡通路活化。
　　 3.ERK表達(dá)于MCD病灶組織和正常皮層中,呈現(xiàn)特征性的44kDa和

13、42 kDa雙條帶(ERK1/2),并可見ERK1/2在MCD中的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　 三、VEGF-D在MCD中的表達(dá)分布
　　 1.正常皮層組織勻漿中,可探及VEGF-D mRNA及蛋白表達(dá);免疫組織化學(xué)結(jié)果表明VEGF-D主要表達(dá)于錐體神經(jīng)元,且免疫反應(yīng)程度較輕。
　　 2.MCD組織勻漿中,VEGF-D mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)。免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn):①TSC亞型中VEGF-D表達(dá)于多數(shù)DNs、GCs及

14、反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞,但免疫陽性強度不一;免疫雙標(biāo)未發(fā)現(xiàn)VEGF-D陽性異構(gòu)神經(jīng)元與NeuN,NF-200,GFAP及CD68共表達(dá);②FCD亞型中可見VEGF-D表達(dá)于DNs,GNs,BCs及反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞,免疫雙標(biāo)結(jié)果表明VEGF-D免疫陽性的異構(gòu)神經(jīng)元不表達(dá)成神經(jīng)纖維蛋白NF-200,亦不表達(dá)成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP。
　　 四、VEGF-C對MCD大鼠異構(gòu)神經(jīng)元NMDA受體功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)
　　 1.建立MCD動物

15、模型,制備活體腦片后進行膜片鉗全細(xì)胞記錄,結(jié)果表明①MCD大鼠異構(gòu)神經(jīng)元可產(chǎn)生動作電位,但動作電位形態(tài)各異,峰率適應(yīng)性降低或消失,提示其電生理功能發(fā)育不完善;②異構(gòu)神經(jīng)元中可記錄到evoked-EPSC,但電流形態(tài)明顯發(fā)生改變,通道電流成分混雜,電流面積明顯增加,提示MCD異構(gòu)神經(jīng)元突觸傳遞效能改變;③MCD異構(gòu)神經(jīng)元中NMDA/AMPA受體介導(dǎo)電流的比率顯著上調(diào),這種比率改變主要是由NMDA受體電流成分增多引起,表明異構(gòu)神經(jīng)元中NMD

16、A受體功能上調(diào)。
　　 2.MCD大鼠異構(gòu)神經(jīng)元中VEGF-C及其受體VEGFR-2的表達(dá)明顯上調(diào),VEGFR-3的表達(dá)辦有增加。
　　 3.100gmol/L NMDA作用于異構(gòu)神經(jīng)元后,可誘發(fā)典型的快反應(yīng)電流,經(jīng)過100ng/mL VEGF-C孵育后,相同濃度NMDA誘發(fā)的電流顯著增大,提示VEGF-C對NMDA受體產(chǎn)生協(xié)同作用;當(dāng)給予VEGFR-2受體阻斷劑Ki8751預(yù)處理后,這種協(xié)同效應(yīng)被阻斷,表明VEGF-C

17、對NMDA受體的調(diào)節(jié)效應(yīng)主要是由VEGFR-2受體介導(dǎo)的。
　　 綜上所述,本研究結(jié)果表明:第一、人MCD組織中VEGF-C及其受體VEGFR-2,VEGFR-3表達(dá)顯著上調(diào),且特征性地高表達(dá)于異構(gòu)神經(jīng)元;第二、MCD中VEGF-C下游通路中抗凋亡相關(guān)信號分子激活,有益地提示VEGF-C可能通過抗凋亡相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)MCD內(nèi)異構(gòu)神經(jīng)元的生物學(xué)行為;第三、VEGF-D在MCD中的表達(dá)上調(diào);第四、VEGF-C通過VEGFR-2增強M