Nogo-A蛋白參與形成大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙及其作用機制研究.pdf

1、大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformations of cortical development，MCD)屬于小兒常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，近年來，由于高清影像學技術(shù)的不斷更新發(fā)展，MCDs的診斷率逐年升高，現(xiàn)已證實在小于3歲的兒童藥物難治性癲癇病人中原發(fā)MCD的病人高達80%，MCD已成為小兒難治性癲癇的重要病因之一。因此，闡明MCD的病理發(fā)生機制對臨床治療MCD及預防難治性癲癇的發(fā)生具有重要意義。在已有癲癇癥狀發(fā)作的MCD病人中

2、，局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)和結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complexes，TSC)是最常見的兩種MCD亞型。雖然臨床表現(xiàn)不盡相同，但兩者在大腦病變區(qū)域具有相同的病理學特征即：
　　 ①皮質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)和柱狀結(jié)構(gòu)紊亂；
　　 ②病灶區(qū)出現(xiàn)大量與癲癇發(fā)作密切相關(guān)的異常細胞即“異構(gòu)神經(jīng)元”(misshapencells)，這些異構(gòu)神經(jīng)元包括：異形神經(jīng)元(

3、dysmorphic neurons，DNs)、巨型神經(jīng)元(giantneurons，GNs)、FCDⅡb中的氣球樣細胞(balloon cells，BCs)以及TSC中的巨細胞(giantcells，GCs)。
　　 現(xiàn)有研究表明，MCD癲癇發(fā)作是異構(gòu)神經(jīng)元“電點燃”病灶臨近腦區(qū)神經(jīng)元后同步放電的結(jié)果，異構(gòu)神經(jīng)元通常被認作是MCD癲癇樣放電的內(nèi)在“促發(fā)器(pacemakers)”，臨床資料也證明伴有異構(gòu)神經(jīng)元的MCD患者出現(xiàn)癲

4、癇發(fā)作的幾率更大。因此，闡明異構(gòu)神經(jīng)元的起源以及病理學發(fā)生對了解MCD的病理學發(fā)展及演變具有重要意義。
　　 病理學上，異構(gòu)神經(jīng)元具有“異形”和“異位”兩個主要特征，異形是指異構(gòu)神經(jīng)元與正常神經(jīng)元相比，形狀異常以及軸突發(fā)育和指向的異常；異位是指異構(gòu)神經(jīng)元的分布的異常，如大量的異構(gòu)神經(jīng)元滯留于白質(zhì)區(qū)造成皮質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂及畸形(無腦回，雙腦回，多腦回等)。異構(gòu)神經(jīng)元的異形和異位均被認為是形成MCD病灶區(qū)興奮性神經(jīng)網(wǎng)絡的重要原因。目前對于

5、異構(gòu)神經(jīng)元的異形，異位病理發(fā)生的相關(guān)機制還沒有明確定論，比較公認的觀點認為胚胎發(fā)育期或皮質(zhì)發(fā)育晚期(圍產(chǎn)期、出生后)神經(jīng)前體細胞(NPCs)向皮質(zhì)遷移時發(fā)生遷移、分化、及成熟障礙，是MCD病灶中的異構(gòu)神經(jīng)元形成的重要因素之一，因此具有調(diào)節(jié)軸突發(fā)育以及NPCs遷移生理功能的相關(guān)分子成為研究關(guān)注的重點。其中，Nogo-A蛋白，一種氨基酸的膜蛋白，因為其特殊的雙重性質(zhì)(軸突生長抑制因子以及NPCs遷移調(diào)控因子)受到我們的關(guān)注。
　　

6、Nogo-A是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白家族成員，廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程，在生理條件下，Nogo-A高表達于哺乳動物的胚胎期，出生后表達逐漸降低且主要表達于少突膠質(zhì)細胞，少部分表達于神經(jīng)元。Chen MS[9]在Nature發(fā)表論著，觀察到Nogo-A在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出強烈的抑制軸突生長的作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A主要與細胞表面受體NgR協(xié)同作用，向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)導Nogo-66細胞生長抑制信號。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Nogo-A蛋白在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)

7、病理損傷中所起的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A在胚胎期神經(jīng)發(fā)育過程中對神經(jīng)干細胞的輻射遷移活力具有抑制作用，應用Nogo-A基因敲除小鼠與野生鼠比較，基因敲除鼠放射遷移的神經(jīng)前體細胞的活動力增強，到達較上的皮層(CP/MZ)的NPCs數(shù)量增加；同樣使用抗體阻斷NgR or LINGO-1，神經(jīng)前體細胞的遷移活性增強；在體外試驗中，體外培養(yǎng)的NPCs在加入一定量重組Nogo-A蛋白后，NPCs放射遷移速率減慢，移動距離縮短。此外，研

8、究表明Nogo-A蛋白富集與神經(jīng)髓鞘的郎飛結(jié)區(qū)可能影響髓鞘表面選擇性離子通道的表達分布。因此，Nogo-A蛋白是一種具備在胚胎期抑制神經(jīng)前體細胞遷移，在成年個體抑制再生神經(jīng)元軸突形成，調(diào)節(jié)選擇性離子通道分布的具有多重性質(zhì)的蛋白，而過去研究對于其在SVZ區(qū)前體細胞遷移中的作用以及其可能的MCD致癇機制研究還未見研究報道。鑒于上述科學研究背景，我們提出以下科學問題：Nogo-A及其受體在MCD中的具體表達模式如何？是否表達于異構(gòu)神經(jīng)元？異常

9、表達的Nogo-A參與病理發(fā)生的可能機制有哪些？
　　 為了闡明Nogo-A蛋白及其信號通路在MCD中的作用及其可能的機制，我們設計以下研究內(nèi)容：
　　 1.利用半定量RT-PCR、Western blot、免疫組織化學技術(shù)觀察了Nogo-A蛋白及其受體在MCD(TSC與FCDⅡb)臨床標本中的表達分布情況；
　　 2.觀測了Nogo-A蛋白下游相關(guān)信號分子(LINGO-1、P75、TROY、RhoA)的表達活化

10、情況；
　　 3.為了調(diào)查Nogo-A對SVZ NPCs向MCD病灶區(qū)遷移的調(diào)節(jié)作用，我們建立MCD大鼠模型，利用eGFP示蹤遷移的NPCs，并通過外源性添加和拮抗Nogo-A蛋白觀察Nogo-A對SVZNPCs向MCD病灶區(qū)遷移的影響，初步揭示Nogo-A蛋白參與異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生的相關(guān)機制。其主要結(jié)果如下：
　　 一、Nogo-A蛋白及其受體在MCD中的表達分布
　　 1.本研究中，我們利用臨床MCDs常見亞

11、型(TSC和FCDⅡb)的手術(shù)切除標本，從基因以及蛋白表達水平證明Nogo-A以及受體NgR在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb皮質(zhì)致癇灶中表達上調(diào)。
　　 2.利用免疫組化和免疫熒光雙標法，我們發(fā)現(xiàn)Nogo-A以及受體NgR在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb的皮質(zhì)致癇灶中的表達定位具有明顯的細胞特異性，即：都高表達于來源于SVZ區(qū)NPCs的異構(gòu)神經(jīng)元上。這些Nogo-A，NgR陽性的異構(gòu)神經(jīng)元，除了FCDⅡb中的一些BCs表現(xiàn)為膠質(zhì)細胞譜系

12、外，大多與神經(jīng)元特異性標志物共表達，表現(xiàn)為神經(jīng)元譜系。這些結(jié)果說明，Nogo-A及其受體可能在這些SVZ NPCs源性的異構(gòu)神經(jīng)元的病理發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　 3.與病灶組織不同，Nogo-A，NgR在鄰近MCDs病灶周圍結(jié)構(gòu)基本正常的組織中的表達并沒有明顯的升高，提示MCDs癲癇發(fā)作可能不是誘導Nogo-A上調(diào)的關(guān)鍵因素。
　　 二、MCD病灶內(nèi)Nogo-A蛋白下游信號通路的表達活化
　　 1.利用West

13、ern blot檢測了Nogo-A下游信號分子，LINGO-1、P75、TORY、RhoA在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb致癇灶中的表達情況，結(jié)果表明下游信號分子LINGO-1、TORY、RhoA在MCDs病灶區(qū)表達上調(diào)，與對照組相比有顯著性差異，而P75表達無明顯變化，提示在MCDs病灶區(qū)，Nogo-A下游的NgR/LINGO-1/TORY-RhoA信號通路被激活。
　　 2.進一步的免疫組化觀察實驗顯示，LINGO-1、TORY

14、、RhoA在不同異構(gòu)神經(jīng)元都有強烈表達，包括DNs、BCs、GCs。
　　 三、Nogo-A蛋白與Nav1.1，Nav1.3通道在MCD病灶區(qū)域內(nèi)細胞定位的相似性分析
　　 1.與正常皮層相比，MCD組織勻漿中Nav1.1基因及蛋白表達沒有明顯變化；而Nav1.3mRNA及蛋白水平則表達明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計學差異，提示Nav1.3而不是Nav1.1可能在FCDⅡb病灶的癲癇樣活動中發(fā)揮重要作用。
　　 2.免疫組化

15、結(jié)果顯示，Nav1.3具有特殊的細胞定位模式，及Nav1.3的免疫反應沉積物主要定位于DNs以及GNs。這種表達方式與Nogo-A的表達定位方式相似，相關(guān)性研究表明Nogo-A表達與Nav1.3表達呈正相關(guān)，這一結(jié)果提示Nogo-A可能與Nav1.3在FCDⅡb病灶區(qū)域的特征性分布密切相關(guān)。
　　 四、Nogo-A蛋白調(diào)節(jié)SVZ來源的神經(jīng)前體細胞遷移的研究
　　 1.本部分研究擬通過動物模型實驗，觀察Nogo-A蛋白在M

16、CD不同時期的空間時間分布情況，以及通過干預方式初步觀察Nogo-A蛋白對SVZ NPCs的遷移調(diào)節(jié)作用。首先，我們建立的FCFL模型，在行為學上，具備了FCD模型動物的行為特征。形態(tài)學、神經(jīng)病理學鑒結(jié)果顯示：該模型的腦皮層出現(xiàn)了FCD典型的微腦回畸形結(jié)構(gòu)。組織學觀察可見原有皮層的正常結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)異常的分層結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元排列紊亂，柱狀極性消失，在微腦回畸形邊緣可見一些神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，偶見一些形態(tài)異常的巨型神經(jīng)元，這些特征與以往的文獻報

17、道相符。因此建立的FCFL模型符合我們進一步實驗的要求，也為后續(xù)研究提供了基礎保障。
　　 2.利用腺病毒轉(zhuǎn)染的eGFP作為示蹤劑，我們成功地對SVZ區(qū)域的NPCs進行了在體(in vivo)示蹤觀察。結(jié)果顯示，eGFP-FCFL模型冰凍損傷灶內(nèi)可見eGFP(+)細胞形成的細胞遷移流(SFMS)。而且，eGFP(+)細胞形成的SFMS持續(xù)存在于P10到P75，及大鼠發(fā)育成熟的各個階段。利用免疫熒光利用免疫熒光雙標技術(shù)，我們對eG

18、FP-FCFL模型SFMS中的eGFP(+)細胞進行了進一步鑒定。結(jié)果顯示，SFMS中eGFP(+)不同程度地表現(xiàn)為PSA-NCAM、DCX以及CRMP4陽性。這一結(jié)果提示，局部皮層冰凍損傷可以激活了SVZ NPCs向病灶區(qū)遷移，微腦回畸形SFMS中的eGFP(+)細胞是由SVZ源性的NPCs遷移而來，這些細胞具有一定的遷移活性，部分仍保留干細胞特性。
　　 3.觀察Nogo-A蛋白在模型組及對照組不同發(fā)育時期的皮質(zhì)區(qū)域的表達情

19、況，結(jié)果顯示Nogo-A蛋白隨著大鼠的發(fā)育在大腦皮質(zhì)中的表達呈逐漸降低的趨勢。而在P10、P20、P30三個時期，模型組相對對照組表達明顯升高，且具有統(tǒng)計學的差異，這一結(jié)果提示在MCD的病理過程中，在一定的時期內(nèi)Nogo-A的表達發(fā)生異常。進一步的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，與對照組中正常神經(jīng)元Nogo-A主要表達與胞膜不同，在模型組微腦回及其微腦旁回的神經(jīng)元細胞中，Nogo-A可見明顯的神經(jīng)元胞漿以及軸突表達，Nogo-A的免疫陽性表達明顯高于

20、對照組皮質(zhì)神經(jīng)元，這些結(jié)果為Nogo-A參與MCD的病理發(fā)生機制提供了形態(tài)學上的依據(jù)。
　　 4.通過在P0期采用重組Nogo-A蛋白及Nogo-A拮抗劑(NEP1-40)的干預研究，結(jié)果顯示提高大腦局部微環(huán)境中Nogo-A表達的含量，遷移到皮質(zhì)畸形區(qū)域中的eGFP(+)細胞減少，SMFS呈線性分布，而拮抗劑組遷移到皮質(zhì)畸形區(qū)域中的eGFP(+)細胞增加，遷移分布更加彌散。這個結(jié)果提示Nogo-A蛋白對SVZ NPCs的遷移有抑

21、制調(diào)節(jié)作用。異常表達的Nogo-A通過對NPCs遷移的異常調(diào)控可能是導致異構(gòu)神經(jīng)元異位分布的重要機制之一。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 第一、Nogo-A蛋白及其受體NgR在MCD病人組織中表達顯著上調(diào)，且在異構(gòu)神經(jīng)元上特征性地高表達；
　　 第二、MCD中Nogo-A下游通路中LINGO-1、TORY、RhoA信號分子被激活，有益地提示Nogo-A可能選擇性地通過激活NgR/TORY/LINGO-1

22、-RhoA(而非NgR/P75/LINGO-1)所執(zhí)行的生物學效應參與MCD的病理發(fā)生；
　　 第三、在FCDⅡb皮質(zhì)病灶區(qū)中，選擇性Nav1.3通道表達與Nogo-A呈正相關(guān)，并具有相似的定位分布，提示Nogo-A可能通過影響Nav1.3通道定位表達參與異構(gòu)神經(jīng)元電生理特性的調(diào)節(jié)；
　　 第四、異常表達的Nogo-A通過對NPCs遷移的調(diào)控可能是Nogo-A蛋白參與異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生的重要機制之一。
　　 總之