Nogo-A參與了高血壓大鼠大腦皮層梗死后遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損傷.pdf

1、目前針對腦梗死的臨床和實驗研究，主要集中在病灶局部，試圖通過搶救半暗帶瀕臨死亡的細(xì)胞、減少梗死灶的面積，以達到降低腦梗死致死和致殘率的目的。在動物實驗中被證明有效的多種神經(jīng)保護藥物，在臨床實踐中卻未見明顯療效。臨床影像學(xué)研究顯示，腦梗死治療效果差不僅由于梗死局部的神經(jīng)元死亡后再生困難，還與腦梗死造成遠(yuǎn)隔部位的損傷有關(guān)。 由于腦局部梗死后遠(yuǎn)隔部位損傷，所出現(xiàn)的癥狀不典型、無明顯特異性，或者被原發(fā)病灶所掩蓋，在臨床上，遠(yuǎn)隔部位損傷的

2、相關(guān)癥狀不容易被發(fā)現(xiàn)。隨著現(xiàn)代神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)展，尤其是各種功能影像學(xué)的出現(xiàn)，遠(yuǎn)隔部位損傷的病灶能被早期發(fā)現(xiàn)，而且病灶與正常組織的區(qū)別更加明顯，遠(yuǎn)隔部位的損傷也逐漸被關(guān)注。腦局部梗死后遠(yuǎn)隔部位的損傷，早期是由于血流代謝不耦合、遞質(zhì)代謝紊亂所致的可逆性神經(jīng)功能聯(lián)系不能；晚期由于遠(yuǎn)隔部位與梗死灶相聯(lián)系的神經(jīng)纖維的軸突變性，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔部位不可逆的進行性萎縮或變性。動物實驗證實，一側(cè)大腦中動脈皮層支阻塞所致的大腦皮層梗死，能導(dǎo)致非缺血區(qū)的丘腦、黑質(zhì)

3、等進行性的神經(jīng)元繼發(fā)性變性或凋亡。這種遠(yuǎn)隔部位損傷機制包括遠(yuǎn)隔部位的代謝紊亂、興奮性毒性、凋亡等。但至今并未解釋為什么在腦梗死急性期后，隨著梗死灶的壞死組織液化、形成中風(fēng)囊，梗死灶體積不再改變，而遠(yuǎn)隔部位的損傷仍在進行性加重。遠(yuǎn)隔部位的損傷的機制還有待進一步闡明。 有研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)局部損傷后，損傷原發(fā)灶和損傷遠(yuǎn)隔部位的軸突變性的機制是不相同的。缺血灶原發(fā)性損傷是直接創(chuàng)傷造成組織死亡的部位，損傷部位的組織碎片主要

4、由侵入血源性的巨噬細(xì)胞快速清除，而在遠(yuǎn)離原發(fā)灶的變性軸突，需經(jīng)過CNS的小膠質(zhì)細(xì)胞捐募、活化，轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞后，才能被清除，需要相當(dāng)長的時間。故在遠(yuǎn)隔部位，移走這些變性組織的時間較損傷原發(fā)灶延遲很多，導(dǎo)致了位于損傷軸突及其磷脂碎片上的軸突生長抑制因子(如Nogo-A等)在變性的神經(jīng)纖維附近持續(xù)存在，形成軸突再生的抑制性環(huán)境。軸突生長相關(guān)的抑制因子包括Nogo-A、磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘相關(guān)糖蛋白(Omgp)。Nogo

5、-A主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是否引起Nogo-A的過表達，還存在很大的爭議；但由于Nogo-A能明顯地抑制軸突的生長、細(xì)胞的擴增和誘導(dǎo)生長錐的塌陷，而阻斷Nogo-A作用的相關(guān)干預(yù)方法能顯著地促進CNS軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，故近年來，對于Nogo-A的研究倍受關(guān)注。Nogo蛋白屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(Reticulon)家族成員，在三種異構(gòu)體(Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C)中，Nogo-A最

6、長，含有1163個氨基酸，分子量為180-260kD，全長存在兩個抑制性功能域：一個是位于細(xì)胞表面的Nogo-66，另一個是長的氨基端區(qū)(Amino-Nogo)，這兩個結(jié)構(gòu)域在抑制軸突生長方面發(fā)揮協(xié)同作用。NEP1-40為Nogo-66(1-40)拮抗肽，能減少CNS磷脂的軸突生長抑制作用。GrandPre T和Li S等發(fā)現(xiàn)NEP1-40能促進脊髓損傷小鼠模型的CST，紅核脊髓束(RST)的增生、提高生長相關(guān)蛋白的表達，這些增生的軸突

7、在促進損傷脊髓的神經(jīng)功能的恢復(fù)中起了重要的作用。 然而，到目前為止，尚不清楚Nogo-A等中樞抑制因子是否通過影響遠(yuǎn)隔部位的軸突變性的過程，而參與遠(yuǎn)隔部位神經(jīng)元損傷。皮層腦梗死后遠(yuǎn)隔部位(如丘腦、黑質(zhì)、脊髓灰質(zhì)等)的Nogo-A表達、Nogo-A與局灶性腦梗死后遠(yuǎn)隔部位神經(jīng)元損傷的關(guān)系，以及其對神經(jīng)功能的影響尚未見研究報道。 本研究把腦梗死灶局部->神經(jīng)通路(軸突變性)->遠(yuǎn)隔部位損傷作為一個整體來研究，通過論證三者的辯

8、證關(guān)系，來證實Nogo-A是否參與了遠(yuǎn)隔部位的損傷。本研究首先觀察了腦梗死后的神經(jīng)功能和梗死灶體積，大腦皮層梗死后遠(yuǎn)隔部位丘腦、黑質(zhì)和脊髓的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡和軸突變性，及其Nogo-A在丘腦、黑質(zhì)和脊髓的表達；然后用NEP1-40阻斷Nogo-A的作用，探討Nogo-A與繼發(fā)性神經(jīng)元死亡和軸突變性的相互關(guān)系，來研究Nogo-A對遠(yuǎn)隔部位的損害作用及其神經(jīng)功能的影響。本實驗為遠(yuǎn)隔損傷的發(fā)生機制和臨床意義提供了動物實驗基礎(chǔ)。 材料與

9、方法: 選用體重60-90g的SD大鼠300只，采用雙腎雙夾法復(fù)制成易卒中型腎性高血壓大鼠(RHRSP)模型，術(shù)前1天以及術(shù)后每周測量血壓1次。RHRSP術(shù)后10～12周，選取血壓穩(wěn)定在180mmHg以上，無自發(fā)性腦卒中表現(xiàn)的高血壓大鼠240只，制備右側(cè)大腦中動脈皮層支閉塞(MCAO)模型。從成功復(fù)制MCAO的大鼠中隨機選取180只，其中60只作為MCAO組，60只作為溶劑組，60只作為NEP140組。另隨機選取穩(wěn)定形成高血壓的

10、RHRSP 60只，僅暴露右側(cè)大腦中動脈(MCA)，但不凝閉動脈，作為假手術(shù)組。MCAO術(shù)后24h，NEP1-40組采用滲透性微泵，持續(xù)側(cè)腦室內(nèi)注入NEP1-40，劑量為89μg/kg/d；溶劑組只注入不含NEP1-40的等量0.0l M PBS(pH=7.4)；假手術(shù)組和MCAO組不給予任何腦室內(nèi)注射。入組大鼠均在MCAO術(shù)前進行相應(yīng)神經(jīng)功能評分訓(xùn)練，MCAO術(shù)后1、2、3、4周，從。MCAO組、溶劑組和NEP1-40組隨機選取10只

11、大鼠進行神經(jīng)功能評分。 各組大鼠在神經(jīng)功能評分后，于MCAO術(shù)后1、2和4周分別取10只，灌注固定后取腦，行冰凍切片，片厚30μm，分別給予Nissl染色，原位末端標(biāo)記(Tunel)法行丘腦、黑質(zhì)的凋亡檢測，免疫組織化學(xué)法檢測丘腦腹后核(VPN)、黑質(zhì)網(wǎng)狀核(SNR)和脊髓的Nogo-A，APP，GAP-43，MAP-2，GFAP，RIP，以及免疫熒光雙標(biāo)法檢測丘腦VPN、黑質(zhì)SNR和脊髓的Nogo-A/APP、Nogo-A

12、/GAP-43、Nogo-A/MAP-2、Nogo-A/RIP。另每組隨機選取30只大鼠，行Western blotting檢測丘腦、黑質(zhì)的Nogo-A蛋白。 免疫組化和Western blotting檢測結(jié)果采用計算機輔助軟件分析系統(tǒng)(Image-Pro-Plus，IPP)進行定量分析。全部數(shù)據(jù)均采用SPSS for Windows 10.0進行統(tǒng)計分析，行單因素方差分析(ANOVA)，比較不同時間點假手術(shù)組、MCAO組、

13、溶劑組和NEP1-40組之間差異的顯著性，P<0.05時，有顯著性意義。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)論: 1．RHRSP大鼠：MCA皮層支閉塞后1周，梗死側(cè)丘腦VPN和黑質(zhì)SNR出現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)元死亡。隨著缺血時間的延長，丘腦vPN和黑質(zhì)SNR神經(jīng)元進行性丟失，其丟失的程度與丘腦VPN和黑質(zhì)SNR進行性的軸突變性相關(guān)。給予NEP1-40阻斷Nogo-A，在MCAO術(shù)后各時間點，均不影響梗死灶的體積，卻減輕丘腦VPN和黑質(zhì)S

14、NR繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。 2．MCAO術(shù)后各時間點，丘腦VPN和黑質(zhì)SNR的Nogo-A的表達在增生少突膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)性增高，Nogo-A陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞分布在損傷的軸突周圍。Nogo-A與APP的表達變化規(guī)律一致，與GAP-43、MAP-2的表達變化規(guī)律相反，NEP1-40干預(yù)使APP的表達減少，GAP-43、MAP-2的表達增多；故Nogo-A促進了軸突變性，抑制了軸突再生。 3．腦梗死局部病灶是遠(yuǎn)隔部位丘腦和黑質(zhì)損傷的