Nogo-A及受體NgR對(duì)大鼠視皮層可塑性調(diào)控作用的研究.pdf

1、第一章、Nogo-A及受體NgR在正常發(fā)育及單眼剝奪模型大鼠視皮層中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　 目的：探討正常發(fā)育過(guò)程及單眼剝奪模型大鼠視皮層中Nogo-A及受體NgR的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及意義。
　　 方法：84只新生SD大鼠隨機(jī)分為6組：0日齡正常組(NorP0，12只)、14日齡正常組(NorP14，12只)、28日齡正常組(NorP28，12只)、60日齡正常組(NorP60，18只)、28日齡模型組(MD

2、P28，12只)以及60日齡模型組(MDP60，18只)，模型組大鼠于出生后21天縫合右側(cè)眼瞼建立單眼形覺(jué)剝奪模型。各組動(dòng)物均依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)處死并取左側(cè)視皮層組織，提取總RNA及蛋白質(zhì)，采用RT-PCR及免疫印跡Western blot方法檢測(cè)視皮層中Nogo-A及NgR的表達(dá)，了解正常發(fā)育及單眼剝奪模型大鼠視皮層中Nogo-A及NgR的動(dòng)態(tài)表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)早期單眼剝奪對(duì)Nogo-A及NgR蛋白表達(dá)影響的

3、層特異性。
　　 結(jié)果：正常新生大鼠(NbrP0)視皮層中即有Nogo-A/NgR mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，其表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而明顯上調(diào)。其中Nogo-A mRNA及蛋白質(zhì)于出生后28天(NorP28)到達(dá)高峰并持續(xù)至成年期(NorP60)；NgR mRNA于出生后14天(NorP14)到達(dá)高峰并持續(xù)至成年期(NorP60)，而NgR蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)則較mRNA滯后，于出生后28天(NorP28)到達(dá)高峰并持續(xù)至成年期(NorP6

4、0)。早期單眼剝奪后，模型組(MDP28、MDP60)大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層中Nogo-A/NgR mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)較同日齡正常組(NorP28、NorP60)輕度減少，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，MDP28組與MDP60組大鼠比較剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層中Nogo-A/NgR mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)顯示Nogo-A及NgR蛋白在NorP60組及MDP60組大鼠視皮層Ⅱ

5、-Ⅲ層，Ⅳ層，Ⅴ層，Ⅵ層中均有表達(dá)，早期單眼剝奪可使MDP60組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層中第Ⅱ-Ⅲ層、Ⅳ層Nogo-A及NgR免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度較NorP60組明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：大鼠Nogo-A/NgR mRNA及蛋白質(zhì)自出生到成年期在視皮層中持續(xù)表達(dá)，且在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期后期達(dá)高峰，視覺(jué)發(fā)育早期單眼剝奪可致其表達(dá)下調(diào)，呈現(xiàn)出一定的視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)依賴性。因此，Nogo-A/NgR在視覺(jué)發(fā)育早期可能主要參與軸突生長(zhǎng)及導(dǎo)向；同時(shí)調(diào)控視皮層可

6、塑性關(guān)鍵期的終止，并對(duì)成年視皮層可塑性發(fā)揮一定的抑制作用。
　　 第二章、NgR拮抗劑NEP1-40對(duì)成年單眼剝奪模型大鼠視皮層可塑性的再激活作用
　　 目的：觀察NgR拮抗劑NEP1-40對(duì)成年單眼剝奪模型大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層結(jié)構(gòu)及功能可塑性再激活的影響，進(jìn)一步闡明Nogo-A/NgR信號(hào)系統(tǒng)對(duì)成年視皮層可塑性的調(diào)控作用。
　　 方法：將120只新生SD大鼠隨機(jī)分為兩大組即正常組和單眼剝奪模型組。按給藥方式不同

7、，正常組又分為正常對(duì)照組(Nor)、正常+PBS治療組(Nor+PBS)、正常+NEP1-40治療組(Nor+NEP)；單眼剝奪模型組又分為模型對(duì)照組(MD)、模型+PBS治療組(MD+PBS)以及模型+NEP1-40治療組(MD+NEP)，每組各20只。模型組大鼠于出生后21天縫合右側(cè)眼瞼建立單眼形覺(jué)剝奪模型，于45日齡時(shí)打開(kāi)剝奪眼，對(duì)各組大鼠行閃光視覺(jué)誘發(fā)電位(F-VEP)檢測(cè)，確定單眼剝奪模型建立成功后，對(duì)需給藥的各組大鼠按組別給

8、予0.02mg/μl的NEP1-40或0.01M的PBS側(cè)腦室注藥治療，每天1次，每次10μl，持續(xù)7天。于52日齡時(shí)對(duì)各組大鼠再次行F-VEP檢測(cè)后處死動(dòng)物，取側(cè)腦室組織行尼氏染色明確給藥部位，取左側(cè)視皮層組織進(jìn)行尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量、高爾基染色觀察樹(shù)突棘密度、透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)尼氏染色觀察側(cè)腦室及視皮層組織結(jié)構(gòu)：未接受側(cè)腦室注藥治療的MD組大鼠，大腦皮層組織結(jié)構(gòu)完整，未

9、見(jiàn)注射針頭的痕跡；接受過(guò)側(cè)腦室注藥治療的MD+PBS組及MD+NEP組大鼠，可見(jiàn)注射針頭經(jīng)大腦皮層向側(cè)腦室方向穿過(guò)的痕跡。此外，接受過(guò)側(cè)腦室注藥治療的MD+PBS組及MD+NEP組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層層次分明，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)較MD組無(wú)明顯差異。
　　 (2)高爾基染色觀察視皮層神經(jīng)元樹(shù)突棘密度：MD組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元樹(shù)突棘密度較Nor組顯著降低(P<0.05)。Nor+PBS組及Nor+NEP組大鼠視皮層

10、神經(jīng)元樹(shù)突棘密度與Nor組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MD+NEP組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層樹(shù)突棘密度較MD組及MD+PBS組明顯增加(P<0.05)，且與Nor組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MD+PBS組與MD組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元樹(shù)突棘密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與Nor組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (3)透射電鏡觀察視皮層神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)：與Nor組比較，MD

11、組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元突觸間隙增大，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度縮短，突觸界面曲率減小，突觸后致密物厚度變薄(P<0.05)。Nor+PBS組及Nor+NEP組大鼠視皮層神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)的各項(xiàng)指標(biāo)與Nor組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MD+NEP組大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)的各項(xiàng)指標(biāo)均較MD組、MD+PBS組明顯改善(P<0.05)，與Nor組相比除突觸間隙外(P<0.05)，其余各項(xiàng)參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>

12、0.05)。MD+PBS組與MD組大鼠比較剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)的各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與Nor組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (4)閃光視覺(jué)誘發(fā)電位評(píng)估大鼠客觀視功能：45日齡時(shí)F-VEP檢測(cè)示，MD組、MD+PBS組及MD+NEP組與Nor組比較，P波潛伏期延長(zhǎng)，波幅降低(P<0.05)；而Nor+PBS組及Nor+NEP組大鼠P波的潛伏期及波幅與Nor組比較差異均無(wú)統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。52日齡時(shí)F-VEP檢測(cè)示，MD組與Nor組比較大鼠右眼F-VEP的P波潛伏期延長(zhǎng)，波幅降低(P<0.05)。Nor+PBS組及Nor+NEP組大鼠右眼F-VEP的P波潛伏期及波幅與Nor組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MD+NEP組與MD組、MD+PBS組大鼠比較右眼F-VEP的P波潛伏期及波幅差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與Nor組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MD+PBS組與MD組

14、大鼠比較，右眼F-VEP的P波潛伏期及波幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與Nor組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：NgR拮抗劑NEP1-40可使成年單眼剝奪模型大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層神經(jīng)元的樹(shù)突棘密度、突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)得以恢復(fù)，F(xiàn)-VEF的P波潛伏期及波幅恢復(fù)至正常水平，重新“激活”被抑制的視皮層結(jié)構(gòu)及功能可塑性。這一研究結(jié)果為Nogo-A/NgR系統(tǒng)參與視皮層可塑性的調(diào)控提供了直接證據(jù)，同時(shí)為成年弱視患