軸突生長抑制蛋白在聽覺剝奪大鼠聽皮層中的表達(dá)及其對聽皮層可塑性調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究通過建立雙側(cè)耳蝸手術(shù)損毀所致聽覺剝奪(AuditoryDeprivation，AD)動物模型，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中三種重要軸突生長抑制蛋白勿動蛋白多肽因子-A(Nogo-A)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(Omgp)及其共同受體Nogo-66受體(NgR)在聽皮層中表達(dá)水平的變化情況進(jìn)行觀察，探究軸突生長抑制蛋白與聽皮層可塑性之間的關(guān)系，并為聽皮層可塑性機(jī)制的進(jìn)一步探索提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:選

2、取72只生后兩周齡健康雄性且耳廓反射正常的SD乳鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各36只。實(shí)驗(yàn)組乳大鼠麻醉后，施行雙側(cè)耳蝸損毀手術(shù)，對照組在相同條件下，只做雙側(cè)耳后切口，不損壞耳蝸。根據(jù)動物術(shù)后飼養(yǎng)的時間不同將對照組和實(shí)驗(yàn)組又分別分為2、4、6、8周四個小組，每個小組9只動物。實(shí)驗(yàn)動物均置于溫度、濕度適宜的屏蔽環(huán)境中喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組與對照組分別于術(shù)后兩周進(jìn)行ABR檢測，將引出Ⅲ波等重復(fù)波形的最小刺激強(qiáng)度定為ABR反應(yīng)閾，判斷動物模型

3、是否成功建立。采用蛋白免疫印跡技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、以及免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)分別于術(shù)前及術(shù)后2、4、6、8周檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠聽皮層Nogo-A、MAG、Omgp、NgR的蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.耳蝸損毀手術(shù)結(jié)果:
　　術(shù)后大鼠進(jìn)食、飲水等活動正常，兩周后無頭頸歪斜，拎尾懸空能保持平衡，無原地反復(fù)轉(zhuǎn)圈等前庭功能損害的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠較正常組大鼠行動遲緩，耳廓反射消失且對噪聲刺激不

4、敏感。
　　2.ABR檢測結(jié)果:
　　ABR測試結(jié)果顯示對照組大鼠雙耳40 SPL dB能引出重復(fù)波形，聽閾為40 dB，而實(shí)驗(yàn)組大鼠雙耳90 SPL dB無法引出重復(fù)波形，聽閾大于90 dB，按依據(jù)1980年WHO對耳聾的分級標(biāo)準(zhǔn)，測聽聽閾超過90 dB為全聾，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耳蝸損毀手術(shù)所致大鼠聽覺剝奪動物模型建造成功。
　　3.免疫熒光組織化學(xué)檢測結(jié)果:
　　Nogo-A、MAG、Omgp、NgR在大鼠聽

5、皮層的神經(jīng)元與腦內(nèi)神經(jīng)纖維髓鞘中有表達(dá)，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)多細(xì)胞形態(tài)，有神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、條索狀神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)或兩者共存。Nogo-A及Omgp的陽性信號分布在細(xì)胞膜和神經(jīng)纖維髓鞘，呈現(xiàn)出神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及條索狀神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)。MAG陽性細(xì)胞僅為條索狀神經(jīng)纖維形態(tài)，陽性信號在神經(jīng)纖維髓鞘分布，NgR陽性細(xì)胞僅為神經(jīng)元形態(tài)，陽性信號在細(xì)胞膜及胞質(zhì)中均有分布。對2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組及對照組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)得:實(shí)驗(yàn)組Nogo-A蛋白平均光密度值A(chǔ)OD

6、依次為0.254、0.368、0.591、0.510，對照組依次為0.233、0.313、0.427、0.368。實(shí)驗(yàn)組NgR AOD值依次為0.390、0.445、0.602、0.507，對照組依次為0.346、0.416、0.529、0.452。實(shí)驗(yàn)組MAG AOD值依次為0366、0.471、0.642、0.513，對照組依次為0.318、0.418、0.603、0.442。實(shí)驗(yàn)組Omgp AOD值依次為0.304、0.481、0

7、.644、0.520，對照組為0.270、0.415、0.560、0.424。激光共聚焦掃描成像顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組Nogo-A、MAG、Omgp、NgR陽性細(xì)胞數(shù)目均有隨時間延長而增加的趨勢，且三種軸突生長抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR增多趨勢相似，其陽性細(xì)胞數(shù)均于術(shù)后6周左右達(dá)到峰值，且其實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，蛋白表達(dá)的平均光密度值顯著增加。
　　4.實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果:
　　Nogo-A、MA

8、G、Omgp及其受體NgR mRNA的熔解曲線分析圖可以看出，各圖中僅出現(xiàn)目標(biāo)基因以及內(nèi)參GAPDH的兩個單一峰，無雜峰和其他產(chǎn)物出現(xiàn)的非特異性熒光，說明本實(shí)驗(yàn)定量準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)組與對照組Nogo-A、MAG、Omgp、NgR mRNA的原始Ct值均有明顯下降趨勢，Ct值越低，表達(dá)量越高。Nogo-A和Omgp mRNA的Ct值于術(shù)后6周降至最低點(diǎn)，MAG和NgR mRNA的Ct值于術(shù)后4周降至最低點(diǎn)，而且Nogo-AmRNA術(shù)后各實(shí)驗(yàn)組C

9、t值明顯低于各對照組。NgR與MAG mRNA術(shù)后2、4周實(shí)驗(yàn)組Ct值明顯低于其對照組，Omgp mRNA術(shù)后2、4、6周的實(shí)驗(yàn)組Ct值明顯低于其對照組。以對照2周組大鼠做校準(zhǔn)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算實(shí)驗(yàn)各小組目的基因的相對表達(dá)量得到:實(shí)驗(yàn)組2、4、6、8周Nogo-A mRNA的2-ΔΔCt均值分別為1.323，2.085，2.792，2.077，NgR為2.028,2.276,1.833,1.688,MAG為1.351,2.809,

10、1.906,1.331, Omgp為1.298，1.616，2.389，1.878。結(jié)合目的基因原始Ct值和2-ΔΔCt值可以看出Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR mRNA無論手術(shù)與否表達(dá)均有隨時間增高趨勢，MAG和NgR mRNA于術(shù)后4周達(dá)到峰值，Nogo-A和Omgp mRNA于術(shù)后6周達(dá)到峰值，達(dá)峰后目的基因表達(dá)均開始下降，且實(shí)驗(yàn)組四個目的基因表達(dá)量均顯著高于對照組。
　　5.Western Blot檢測結(jié)果:

11、
　　在200 kD，100 kD，25 kD，66 kD處分別呈現(xiàn)Nogo-A、MAG、Omgp、NgR特異性蛋白表達(dá)條帶。以GAPDH(37kD)作為內(nèi)參校正上樣量的一致性，2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組Nogo-A灰度比均值分別為0.275、0.389、0.460、0.343，對照組為0.110、0.131、0.162、0.122。實(shí)驗(yàn)組NgR為0.097、0.107、0.149、0.120，對照組為0.065、0.070、0.08

12、1、0.072。實(shí)驗(yàn)組MAG為0.248、0.365、0.478、0.327，對照組為0.195、0.257、0.309、0.276。實(shí)驗(yàn)組Omgp為0.173、0.320、0.405、0.3445，對照組為0.092、0.257、0.309、0.276。結(jié)果顯示Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的蛋白表達(dá)隨年齡增長有相似的增加趨勢，實(shí)驗(yàn)組與對照組均在6周組出現(xiàn)峰值，隨后實(shí)驗(yàn)組與對照組表達(dá)均開始下調(diào)。Nogo-A、Omgp、N

13、gR蛋白表達(dá)2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組與對照組相比明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MAG蛋白表達(dá)4、6周實(shí)驗(yàn)組與對照組相比表達(dá)量均明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1.雙側(cè)耳蝸損毀手術(shù)是一種建立聽覺剝奪大鼠模型的既穩(wěn)定又可靠的方法。
　　2.三種軸突生長抑制蛋白及其受體在大鼠聽皮層有表達(dá)。
　　3.正常發(fā)育的大鼠在聽覺發(fā)育關(guān)鍵期聽皮層即有軸突生長抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的表達(dá)，隨生長發(fā)育表達(dá)逐漸升

14、高并于生后4～6周達(dá)到峰值，隨后表達(dá)開始下調(diào)，這可能是因?yàn)樯蟀l(fā)育早期以及聽覺發(fā)育關(guān)鍵時期，軸突生長抑制蛋白及其受體介導(dǎo)軸突伸長，對神經(jīng)纖維及軸突的作用以修復(fù)、促進(jìn)為主，隨著發(fā)育至成年以后，軸突生長抑制蛋白及受體的作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐种戚S突過度生長。
　　4.耳蝸損毀所致聽覺剝奪的大鼠，外周聽器損傷后，聽皮層軸突生長抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的表達(dá)與正常發(fā)育至相同時間的大鼠相比顯著升高，達(dá)峰時間與正常發(fā)育大鼠

15、相似但表達(dá)量明顯增高。這可能是因?yàn)槎亾p毀導(dǎo)致外周聽器損傷初期，軸突生長抑制蛋白及其受體主要參與修復(fù)神經(jīng)纖維、促進(jìn)神經(jīng)及軸突生長的過程，當(dāng)新的突觸與髓鞘逐步形成，聽皮層逐步建立起新的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)后，表達(dá)開始逐漸下調(diào)，此后對神經(jīng)纖維及軸突的作用以抑制過度生長為主，這也說明外周聽器損傷確實(shí)可導(dǎo)致高級聽覺中樞的可塑性變化，而且軸突生長抑制蛋白及其受體參與了昕皮層神經(jīng)元可塑性調(diào)控，同時也間接證明了大鼠聽皮層是一個具有高度可塑性的大腦皮層特異性功能區(qū)