實驗性大腦皮層梗死后EphB2對神經再生和血管增生的影響.pdf

1、研究背景： 腦梗死后神經再生和血管增生機制盡管尚未明確，但可能與神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、促紅細胞生成素、Notch通路等有關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干預EphB2可促進SVZ Nestin陽性細胞活化，提示EphB2可能是腦梗死后細胞增殖的調節(jié)因素。然而，這些增殖細胞是否具有向神經元分化的潛能、梗死灶周神經再生以及EphB2是否調節(jié)腦梗死后血管增生尚未明確。此外，EphB2對腦梗死后遠隔部位細胞增生和血管新生的作用如何？本研

2、究擬在前期工作基礎上進一步闡明這些問題。 研究目的： 本課題擬首先觀察局灶性大腦皮層梗死后內源性神經再生和血管增生情況；進而利用滲透性微泵持經側腦室持續(xù)給予外源性EphB2-Fc，評估干預EphB2對大腦皮層腦梗死后神經功能的影響；探討EphB2對大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周和遠隔部位神經再生的調節(jié)作用；進而探討EphB2對腦梗死后SVZ、梗死灶周及丘腦血管增生的可能作用。因此，本研究有助于揭示腦梗死后神經再生和血管增

3、生的可能調節(jié)靶點，并為腦梗死后促進神經功能恢復提供實驗依據(jù)。 材料和方法： 采用體重70～90g SD大鼠240只按照本課題組方法建立易卒中型腎性高血壓大鼠模型。RHRSP術后10周，選取血壓>180mmHg，且無自發(fā)性腦卒中表現(xiàn)的高血壓大鼠198只建立右側大腦中動脈皮層支閉塞模型。MCAO術后24h隨機選取6只進行TTC顯色以明確梗死灶位置和分布。按照隨機化原則分為4組：MCAO組、MCAO+EphB2-Fc組和IgG

4、—Fc組；假手術組大鼠僅暴露大腦中動脈而不凝閉。MCAO術后24h MCAO+EphB2-Fc組大鼠利用滲透性微泵經側腦室給予重組小鼠EphB2-Fc；IgG—Fc組大鼠采用同樣方法給予相同劑量的重組人IgG—Fc作為對照。 各組大鼠MCAO術后7d、14d和21d分別進行神經功能評分后選取8只取材后進行冰凍切片。Nissl染色評估梗死灶體積：免疫組織化學方法觀察EphB2、ephrinB2的表達以及側腦室注射后外源性EphB2

5、-Fc在腦內的分布；免疫熒光檢測各組大鼠MCAO術后不同時間點SVZ BrdU、BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/GFAP、BrdU/NeuN和PSA—NCAM陽性細胞數(shù)；梗死灶周和同側紋狀體BrdU、BrdU/NeuN陽性細胞及丘腦BrdU陽性細胞；檢測SVZ、梗死灶周及丘腦BrdU/Laminin陽性細胞評價血管內皮細胞增殖。 全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 for windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。

6、 結果： 1.TTC顯色 為明確梗死灶的位置和范圍，MCAO術24h隨機選取6只大鼠進行TTC顯色. 2.EphB2的表達及外源性EphB2-Fc的分布 免疫組化結果顯示：EphB2表達于SVZ，細胞形態(tài)較小，沿側腦室壁分布，MCAO術后7d、14d同側SVZ EphB2表達水平較假手術組明顯減少，其后逐漸升高，MCAO術后21d恢復至假手術組水平。免疫熒光雙標顯示：梗死灶同側SVZ EphB2表達于

7、BrdU+細胞；EphB2配體ephrinB-2表達于vWF陽性血管。經側腦室注射EphB2-Fc后免疫熒光。 3.EphB2-Fc對腦梗死后神經功能和梗死灶體積的影響 MCAO術前1周和術后1、2、3周各組大鼠采用神經功能嚴重程度評分和平衡木行走試驗分別評價總體神經功能嚴重程度和運動平衡功能。假手術組大鼠未見任何神經功能缺損。MCAO組大鼠術后7d、14d和21d NSS和平衡木試驗評分顯示大鼠神經功能明顯低于假手術

8、組。 4.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ神經再生和血管增生 4.1.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ細胞增殖 免疫熒光檢測BrdU陽性細胞評價新生細胞。結果顯示：MCAO術后各時間點MCAO和IgG—Fc組大鼠同側SVZ BrdU陽性細胞數(shù)均無顯著差異。 4.2.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ新生細胞表型 免疫熒光檢測同側SVZ增殖細胞Nestin、DCX、GFAP和NeuN的表達評價新生細胞

9、向神經或膠質細胞分化情況。Nestin主要表達于神經干細胞，結果顯示：MCAO術后同側SVZ存在少量BrdU+/Nestin+細胞，沿SVZ側壁和前角分布。EphB2-Fc干預后梗死灶同側SVZ BrdU+Nestin+細胞明顯增加。 4.3EphB2-Fc與腦梗死后細胞遷移 免疫熒光檢測嗣側SVZ PSA—NCAM+細胞，結果顯示：假手術組SVZ前角存在少量PSA—NCAM+細胞。MCAO術后PSA—NCAM+細胞增

10、多，并以SVZ前角周圍最為明顯，并可見PSA—NCAM+細胞沿胼胝體向梗死灶方向遷移。EphB2-Fc組梗死灶同側SVZ前角和胼胝體下PSA—NCAM+細胞顯著增多，可見大量PSA—NCAM+/BrdU+細胞。 4.4.EphB2-Fc與腦梗死后SAZ血管內皮細胞增殖 BrdU標記增殖細胞，Laminin標記血管，BrdU+/Laminin+細胞則提示血管內皮細胞增殖。結果顯示：假手術組梗死灶同側SVZ未見BrdU+/

11、Laminin+細胞。 4.5.EphB2-Fc與腦梗死后SVZ血管密度 采用FITC—dextran顯示微血管密度和血管通透性。結果顯示：MCAO術后梗死灶同側SVZ側壁、前角及胼胝體處血管密度較假手術組有所增多；而EphB2-Fc干預后梗死灶同側SVZ可見大量綠色熒光顯示的血管。 5.EphB2-Fc與梗死灶周神經再生和血管增生 5.1.EphB2-Fc與梗死灶周神經再生 采用BrdU、Neu

12、N分別檢測增殖細胞和成熟神經元，BrdU+/NeuN+細胞則提示新生成熟神經元。結果顯示：MCAO術后腦梗灶周存在少量BrdU+細胞。 5.2.EphB2-Fc與梗死灶周血管內皮增殖 假手術組大鼠幾乎未觀察到BrdU+/Laminin+細胞，而MCAO術后梗死灶周BrdU+/Laminin+細胞增多；經側腦室EphB2-Fc干預后梗死灶周BrdU+/Laminin+細胞數(shù)較IgG—Fc組大鼠明顯增多。 5.3.E

13、phB2-Fc與梗死灶周血管密度 假手術組大鼠大腦皮層可見正常血管分布。MCAO術后梗死灶中心無血流灌注，而且梗死灶周血管密度顯著下降：EphB2-Fc干預后梗死灶周血管密度較IgG—Fc對照組顯著增多，而且血管增生區(qū)血管周可見明顯FITC—dextran熒光。 6.梗死灶周神經可塑性 Western blot檢測SYN和GAP—43評價梗死灶周軸突再生。結果顯示：MCAO術后2周時梗死灶周SYN和GAP—43

14、表達較假手術組均明顯增多，而MCAO術后3周時逐漸降低至假手術組水平；EphB2-Fc干預組大鼠MCAO術后2周時梗死灶周SYN和GAP—43表達均顯著高于IgG—Fc組。 7.遠隔部位血管增生和細胞增殖 7.1.EphB2-Fc與梗死灶同側丘腦血管內皮細胞增殖 假手術組丘腦腹后核未見明顯BrdU+/Laminin+細胞，而MCAO術后梗死灶同側VPN存在少量BrdU+/Laminin+細胞。 7.2.E

15、phB2-Fc與梗死灶同側丘腦血管密度 FITC—dextran顯示VPN微血管密度和血管通透性。結果顯示：MCAO術后3周內梗死灶同側VPN血管密度較假手術組均明顯增多；EphB2-Fc干預后梗死灶同側VPN血管密度較IgG—Fc組顯著增多，而且血管密度的增加在MCAO術后1周時較為明顯，術后2周達到高峰，并可持續(xù)至MCAO術后3周；高倍鏡下血管增生區(qū)血管周可見明顯FITC—dextran熒光。 7.3.EphB2-

16、Fc與梗死灶同側丘腦細胞增殖 免疫熒光檢測腦梗死后同側VPN BrdU+細胞。結果顯示：假手術組丘腦VPN幾乎未觀察到BrdU+細胞，而MCAO術后1周梗死灶同側VPN BrdU+細胞明顯增多；EphB2-Fc干預后同側VPN BrdU+細胞顯著多于IgG—Fc組，而且BrdU陽性細胞多分布在血管周。BrdU陽性細胞計數(shù)顯示：MCAO術后3周內同側VPN BrdU+細胞較假手術組均明顯增加；EphB2-Fc干預后梗死灶同側VPN

17、 BrdU+細胞較IgG—Fc組顯著增加，術后14d時增加最為明顯，其后逐漸下降，但在MCAO術后21d仍高于IgG—Fc組。 結論： 1.大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周存在神經再生；EphB2-Fc干預后明顯促進梗死灶同側SVZ細胞增殖、遷移、分化以及梗死灶周神經再生，表明EphB2調節(jié)腦梗死后神經再生。 2.大腦皮層梗死后SVZ、梗死灶周存在血管增生；EphB2-Fc能夠促進同側SVZ和腦梗死灶周血管內皮細胞