正丁基苯酞對實驗性腦缺血小鼠腦梗死后血管新生的研究.pdf

1、目的：
　　血管新生對腦梗死慢性期的大腦重塑和神經(jīng)功能恢復十分有益[1]。已有研究表明正丁基苯酞Dl-3n-Butylphthalide(NBP)在實驗性腦梗死中起腦保護作用，并可促進腦梗死后血管新生[2-5]。然而其促進腦梗死后血管新生的機制尚不是十分明確，其形成的新生血管是否為有功能的血管仍待證實，因為有功能的血管新生對神經(jīng)功能恢復才是真正有意義的。本實驗通過對雄性C57BL／6小鼠實行電燒灼閉塞大腦中動脈(permanent

2、 distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)以制備皮層局灶性腦缺血模型，梗死后連續(xù)給予消旋正丁基苯酞14天，從促血管生成因子表達、血管密度、血管通透性、腦血流等方面系統(tǒng)地研究腦缺血后血管新生情況，并評價其神經(jīng)功能改善情況。
　　方法：
　　選擇雄性C57BL／6小鼠(年齡8-12周，體重20-25 g)。皮層局灶性腦缺血模型制備需先永久性結(jié)扎雄性C57BL／6小鼠小鼠的右側(cè)頸

3、總動脈，然后在體式顯微鏡下燒灼右側(cè)大腦中動脈的皮層分支。將實驗動物隨機分為三組，分別為假手術(shù)組（Sham），溶劑對照組（Vehicle），用藥組（NBP）。于造模后1小時開始腹腔給予藥物或等體積溶劑，其中用藥組給予NBP（20 mg/kg），假手術(shù)組和溶劑對照組給予等體積溶劑0.5％吐溫-80，連續(xù)14天。分別于造模后1、3、7、14、21、28天對各組小鼠進行疲勞轉(zhuǎn)棒實驗（Rotarod Test）以獲得神經(jīng)功能評分，28天后取材并用

4、HE染色法測定腦萎縮體積；于造模后7、14、28天用免疫熒光染色測定血管密度，新生血管增殖率及周細胞包裹率；于造模前、即刻、3、7、14、28天測梗死側(cè)皮層腦血流變化；，于造模后3、7、14天應用蛋白免疫印記（Western blot）檢測促血管新生因子如VEGF,Ang-1,N-Cadherin表達情況。
　　結(jié)果：
　　1正丁基苯酞可促進實驗性腦缺血小鼠的神經(jīng)功能改善
　　本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后1小時給予正丁

5、基苯酞20mg/kg對實驗性腦缺血小鼠神經(jīng)功能改善明顯優(yōu)于正丁基苯酞40mg/kg，所以本實驗選用對神經(jīng)功能改善最佳的劑量20mg/kg進行實驗研究。造模前所選小鼠均為在轉(zhuǎn)棒上維持時間60秒以上者，而造模1天后Vehicle組和NBP組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，且未見明顯差異；3天神經(jīng)功能評分NBP組稍優(yōu)于Vehicle組，但差異無統(tǒng)計學意義（Vehicle VS．NBP:3天:41.97±10.43 VS．48.73±3.44（P>0.0

6、5））；自7天起至28天NBP組神經(jīng)功能評分明顯高于Vehicle組，且差異具有統(tǒng)計學意義（Vehicle VS．NBP:7天:44.76±7.35 VS．61.42±5.74（P<0.05）;14天:40.33±8.68 VS．61.91±8.37（P<0.05）;21天39.91±8.66 VS．59.73±6.41（P<0.05）；28天34.03±5.10 VS．63.82±3.75（P<0.05））（Fig.1A）。說明NBP

7、20mg/kg可明顯改善腦缺血小鼠神經(jīng)功能。
　　2正丁基苯酞對實驗性腦缺血小鼠梗死后28天腦萎縮體積無明顯影響
　　造模后28天兩組小鼠腦萎縮體積差別不大，且無統(tǒng)計學意義（Vehicle VS．NBP:28天:7.56%±1.75%VS．5.77%±1.30%（P>0.05））（Fig.1B）。說明正丁基苯酞對腦缺血小鼠腦萎縮體積無影響。
　　3正丁基苯酞促進腦缺血小鼠梗死邊緣新生血管增殖同時增加了血管密度
　

8、　造模后第7天腦缺血小鼠梗死邊緣開始出現(xiàn)Brdu+血管，即發(fā)生新生血管增殖，但兩組差別無統(tǒng)計學意義（Vehicle VS． NBP:7天:12.03%±1.64%VS．13.29%±1.85%（P>0.05））；第14天NBP組梗死邊緣Brdu+血管百分比較Vehicle組明顯增加，且差別具有統(tǒng)計學意義（Vehicle VS． NBP:14天:13.41%±1.44%VS．24.61%±2.33%（P<0.05））（Fig.2 C,D）

9、。據(jù)統(tǒng)計，7天時兩組小鼠梗死邊緣血管密度無差別，14天時發(fā)現(xiàn)NBP組小鼠梗死邊緣血管密度較Vehicle組明顯增多，且差別有統(tǒng)計學意義（Vehicle VS． NBP:14天:11.77%±1.09%VS．14.70%±0.53%（P<0.05））；到28天NBP組小鼠梗死邊緣血管密度仍顯著多于Vehicle組，且差別有統(tǒng)計學意義（Vehicle VS． NBP:28天13.61%±0.95%VS．16.68%±0.46%（P<0.05

10、））（Fig.2 A,B）。
　　4正丁基苯酞可增加腦缺血小鼠梗死邊緣區(qū)域微血管周細胞包裹率
　　腦梗死后14天，NBP組腦梗死邊緣血管周細胞包裹率較Vehicle相比顯著增高，且與差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；至腦梗死后28天梗死周邊周細胞微血管內(nèi)皮細胞包裹率較14天增加，且和Vehicle相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（Fig.3 A,B）。
　　5正丁基苯酞可改善腦缺血小鼠血腦屏障滲透性
　　腦梗

11、死后7天、14天NBP治療組腦組織伊文思藍滲出率（梗死側(cè)/梗死對側(cè)）明顯低于Vehicle組，且差別有統(tǒng)計學意義（Vehicle VS．NBP:7天:5.8105±0.58719VS.2.4505±0.09629（P<0.05）;14天:2.2025±0.17158 VS．1.7162±0.12084（P<0.05）），從7天到14天再到28天，腦組織伊文思藍滲出率逐漸減低，28天時腦組織伊文思藍滲出率降到最低，與正常組織相似（Fig.

12、3 C）。
　　6正丁基苯酞可增加腦缺血小鼠皮層腦血流灌注量
　　激光散斑血流成像結(jié)果顯示了腦梗死后各時間點的皮層腦血流灌注量，其中可發(fā)現(xiàn)梗死后14天NBP組皮層腦血流灌注量比高于Vehicle組，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（Fig.4）。由此我們可推論正丁基苯酞可增加腦梗死小鼠皮層腦血流灌注量。
　　7正丁基苯酞可增加腦缺血小鼠皮層腦組織中調(diào)節(jié)血管生成與成熟因子VEGF,Ang-1,N-Cadherin的蛋白表達

13、
　　Western Blot結(jié)果顯示，腦梗死后VEGF、Ang-1、N-Cadherin蛋白在梗死側(cè)大腦皮層表達增高。VEGF在腦梗死后3天表達顯著增高，且NBP治療組表達高于Vehicle組，VEGF表達在7天時仍較顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Ang1蛋白表達在腦梗死后3天、7天較Vehicle組明顯增高，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。N-Cadherin自腦梗死后3天表達開始升高，且NBP組較Vehicle組更