干預(yù)供肝CⅡTA與MyD88基因表達(dá)抑制大鼠肝移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對(duì)干預(yù)供肝CⅡTA與MyD88基因表達(dá)抑制大鼠肝移植排斥反應(yīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：納米載體HGPAEs的制備及檢測(cè)。
　　 目的：制備納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)并觀察其體內(nèi)應(yīng)用的安全性與有效性。
　　 方法：制備納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，并對(duì)其進(jìn)行性能測(cè)試;設(shè)置生理鹽水組、納米載體組和納米載體質(zhì)粒組，經(jīng)門靜脈注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠肝臟

2、，采取轉(zhuǎn)染后第一天和第三天肝臟標(biāo)本和靜脈血，應(yīng)用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)方法評(píng)價(jià)體內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)染效果，并檢測(cè)大鼠肝腎功能變化。
　　 結(jié)果：成功制備了納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，經(jīng)驗(yàn)證其具有作為基因載體的必備條件;第一天和第三天納米載體質(zhì)粒組的增強(qiáng)型綠熒光蛋白熒光強(qiáng)度均顯著強(qiáng)于生理鹽水對(duì)照組和納米載體組(P＜0.01)，納米載體質(zhì)粒組第三天熒光強(qiáng)度強(qiáng)于第一天(P＜0.01);轉(zhuǎn)染術(shù)后第一天，與正常值比較，各組ALT、

3、AST均顯著升高(P＜0.01)，但各組間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染術(shù)后第三天，各組生化指標(biāo)均趨于正常。
　　 結(jié)論：納米載體組氨酸接枝聚（β-氨基酯）制備簡(jiǎn)便，是一種安全高效的基因載體;以納米載體為介導(dǎo)經(jīng)門靜脈注射的方法可使shRNA質(zhì)粒在體內(nèi)肝臟獲得高效轉(zhuǎn)染。
　　 第二部分：納米載體介導(dǎo)沉默基因CⅡ TA和MyD88表達(dá)的體內(nèi)研究。
　　 目的：觀察RNA干擾對(duì)免疫識(shí)別相關(guān)基因CⅡTA、MHC-Ⅱ

4、和MyD88表達(dá)的抑制效果。
　　 方法：設(shè)置生理鹽水對(duì)照組、納米載體組、納米載體pHK-shRNA組和納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組、納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組三個(gè)干預(yù)組，通過(guò)門靜脈注射方法體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，轉(zhuǎn)染后第三天取肝臟，以熒光定量PCR和western blot分別檢測(cè)肝臟轉(zhuǎn)染后CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　

5、 結(jié)果：熒光實(shí)時(shí)定量PCR和western blot檢測(cè)顯示納米載體pCⅡ TA-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組CⅡ TA和MHCⅡ基因mRNA和蛋白表達(dá)均較生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-shRNA組顯著降低(P＜0.01);納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組MyD88基因mRNA和蛋白表達(dá)較生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-shRNA組也有顯

6、著降低(P＜0.01);而納米載體組、納米載體pHK-shRNA組與生理鹽水組之間CⅡ TA、MHCⅡ和MyD88基因無(wú)論mRNA還是蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：以納米載體(HGPAEs)為介導(dǎo)經(jīng)門靜脈注射的方法，應(yīng)用針對(duì)CⅡ TA和MyD88的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，可顯著抑制肝臟CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因表達(dá)。
　　 第三部分：干預(yù)供體移植物抑制大鼠肝移植排斥反應(yīng)的研究。

7、>　　 目的：觀察抑制供體肝臟CⅡ TA和MyD88基因的表達(dá)對(duì)高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型移植排斥反應(yīng)的影響，探討其抗排斥機(jī)制。
　　 方法：建立高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型;設(shè)置生理鹽水組、納米載體組、pHK-shRNA納米載體組、納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡTA-pMyD88-shRNA組，各組采用經(jīng)門靜脈注射的方法干預(yù)供體大鼠肝臟，干預(yù)后3天取肝臟進(jìn)行肝移植，每組各12

8、只大鼠，于移植術(shù)后第5天隨機(jī)選取6只大鼠取靜脈血和移植肝臟，病理切片確定排斥反應(yīng)分級(jí)，分別采用熒光定量PCR和western blot檢測(cè)肝臟中CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血中CD4/CD8細(xì)胞比例， ELISA法檢測(cè)血清IL-2和IFN-γ濃度，并檢測(cè)肝功能，其余6只用于觀察存活期。
　　 結(jié)果：穩(wěn)定建立高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型;與生理鹽水組、納米載體組和納米載體pHK-

9、shRNA組相比，納米載體pCⅡ TA-shRNA組、納米載體pMyD88-shRNA組和納米載體pCⅡ TA-pMyD88-shRNA組大鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)（中位生存期16天、14天和21天vs10天、9天和8天，P＜0.01），排斥反應(yīng)病理分級(jí)明顯降低(P＜0.01)，CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量均明顯降低(P＜0.01)，血液CD4/CD8細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.01)，血清IL-2和IFN-