轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)轉(zhuǎn)人白細(xì)胞介素-10基因抗大鼠肝移植排斥反應(yīng)及其對大鼠部分肝移植肝再生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，人白細(xì)胞介素-10基因的克隆及轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)的構(gòu)建.目的:人白介素10基因的克隆和轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)的構(gòu)建.方法:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),從活化的正常人外周血單個核細(xì)胞中擴(kuò)增出hIL-10cDNA,將測序正確的hIL-10cDNA克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3構(gòu)建重組表達(dá)載體.結(jié)論:所構(gòu)建的含目的基因的載體和轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)為下一步研究IL-10在移植免疫中的作用,提供了條件.第二部分，轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)轉(zhuǎn)人白細(xì)胞介素-10基因抗

2、大鼠肝移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.目的:研究SB轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)轉(zhuǎn)hIL-10基因誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植抗排斥反應(yīng)的機(jī)制.方法:采用"二袖套"法建立SD-Wistar同種異體大鼠急性排斥模型,實(shí)驗(yàn)分組:1.對照組:未進(jìn)行任何治療n=6;2.空白DOTAP組:n=6;3.DOTAP組治療組:n=6;4.轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)hIL-10基因治療組:n=6;5.FK506治療組:n=6.術(shù)后2d、4d、7d、14d眼眶采血,收集血清,生化檢測轉(zhuǎn)氨酶水平.ELIS

3、A檢測DOTAP組治療組和轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)hIL-10基因治療組hIL-10表達(dá),RT-PCR檢測移植物內(nèi)細(xì)胞因子mRNA.原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡.同時觀察各組大鼠肝移植后的生存期.結(jié)論:IL-10具有抗大鼠排斥反應(yīng)的作用,延長大鼠生存期.其機(jī)理主要是通過過度表達(dá)的IL-10通過促進(jìn)移植物內(nèi)浸潤T細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)特異性無反應(yīng)性,抑制了免疫反應(yīng)的識別階段.第三部分，不同冷缺血時間及轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)hIL-10基因?qū)Υ笫蟛糠指我浦残g(shù)后肝

4、再生的影響.目的:建立新的穩(wěn)定50﹪大鼠部分肝移植的模型上,研究不同冷缺血時間及經(jīng)門靜脈灌注SB轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)轉(zhuǎn)IL-10基因?qū)σ浦残g(shù)后存活率和肝再生的影響.方法:Ⅰ組為對照組:50﹪肝切除;實(shí)驗(yàn)組:50﹪部分肝移植Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組(分別為冷缺血時間45min、4hr、10hr和4hr+經(jīng)門靜脈灌注SB轉(zhuǎn)座元系統(tǒng)轉(zhuǎn)IL-10基因).觀察各實(shí)驗(yàn)組生存率,并分別于移植術(shù)后24h、48h、96h免疫組化檢測各實(shí)驗(yàn)組增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、TN

5、F-α和IL-6的表達(dá),半定量RT-PCR檢測TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá),免疫組織化學(xué)檢測hIL-10在轉(zhuǎn)基因組中1d和4d的表達(dá).采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析不同冷缺血時間及轉(zhuǎn)IL-10基因?qū)Υ笫蟛糠指我浦残g(shù)后24小時存活率和肝再生的影響.結(jié)論:部分肝移植術(shù)后肝再生峰值較肝切除后延遲,冷缺血時間的延長降低了TNF-α和IL-6的表達(dá),導(dǎo)致部分肝移植術(shù)后肝細(xì)胞肝再生的能力和移植術(shù)后存活率的下降.轉(zhuǎn)座元介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)基因通過抑制TNF-