A20人工鋅指轉錄因子真核載體的構建及其對內皮細胞炎癥反應的影響及其機制的研究.pdf

1、背景:
　　缺血性腦血管病已成為臨床上的常見病、多發(fā)病,致殘率、病死率及復發(fā)率均高。近年來,影像學發(fā)展突飛猛進,血管內介入治療腦血管病在臨床上廣泛開展,使缺血性腦血管病復發(fā)率、病死率顯著降低。但是由于經(jīng)皮血管成形術(percutaneous transluminal angioplasty PTA)如支架植入、球囊擴張等導致血管狹窄部位局部損傷,引起血管過度修復反應,導致術后再狹窄成為了該項治療的發(fā)展的瓶頸。一項CREST試驗研究

2、表明,頸動脈支架術后,兩年內再狹窄的發(fā)生率為6.0％,在吸煙、高血壓、高血脂及糖尿病患者發(fā)生率更高[1]。因此再狹窄防治不容忽視。在血管成形術后再狹窄的病理生理機制研究中,人們發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞的損傷是這一系列病理過程的始動因素[2],可以引起血管平滑肌細胞病理性增殖等系列改變。而炎癥反應在內皮損傷中起關鍵的作用[3]。因此,血管成形術以后炎癥反應的防治成為了防治再狹窄的關鍵。
　　目前大量研究表明A20基因是內皮細胞保護性基因,同

3、時具有抗炎作用[4-5],因此A20基因可能具有抑制再狹窄的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶A20基因的血管內支架能明顯改善支架術后再狹窄,說明通過A20修飾可構建具有抗再狹窄作用的血管內支架[6]。但是支架直接攜帶目的基因存在著效率低、穩(wěn)定性差等問題。人工鋅指轉錄因子(zinc finger–artificialtranscription factor ZF-ATF)技術能夠高效穩(wěn)定地誘導目的基因表達。本課題主要構建A20基因ZF-ATF的

4、真核表達載體,啟動內源性A20基因的高水平表達,研究其生物學功能,為最終構建擁有自主知識產權的ZF-ATF修飾的血管內支架奠定基礎。
　　目的:
　　1.構建A20基因的人工鋅指轉錄因子(ZF-ATF)的真核表達載體。
　　2.觀察ZF-ATF轉染人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)后對內源性A20基因的表達調控及對HUVEC細胞增殖、遷移能力的影

5、響。
　　3.研究人工鋅指轉錄因子對LPS誘導的內皮細胞炎癥反應的影響并探討其可能的機制。
　　方法:
　　1.根據(jù)人A20基因ZF-ATF的序列,設計出其引物,以質粒DNApUC19-ZF-ATF為模板,通過PCR擴增出目的基因片段ZF-ATF,再通過BamHⅠ和KpnⅠ酶切后的載體連接產生ZF-ATF真核載體,重組質粒轉化感受態(tài)細菌DH5α,篩選陽性克隆,提取質粒,限制性內切酶酶切鑒定,鑒定陽性克隆進行測序。

6、>　　2.ZF-ATF轉染HUVEC細胞,用含G418300μg/mL的1640培養(yǎng)液進行穩(wěn)定細胞株的篩選。
　　3.通過Westernblot檢測轉染ZF-ATF后內皮細胞內源性A20蛋白的表達。
　　4.MTT實驗觀察轉染ZF-ATF后HUVEC細胞的增殖能力,transwells實驗檢測HUVEC細胞遷移能力。
　　5.用脂多糖(LPS)誘導HUVEC細胞產生炎癥反應,利用Western blot檢測NF-κBp

7、65的表達情況,利用ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-8等。
　　6.實驗數(shù)據(jù)采用GrapPad Prism 5軟件處理,Mann-Whitney U檢驗用于比較炎癥因子的差異。
　　結果:
　　1.通過限制性內切酶酶切鑒定及DNA測序證實ATF插入正確,成功構建A20人工鋅指轉錄因子的真核表達載體。
　　2.ZF-ATF轉染HUVEC細胞,成功篩選出HUVEC細胞穩(wěn)定表達系,Western blot證實

8、ZF-ATF轉染HUVEC后內源性A20蛋白表達量顯著增加(P<0.01)。
　　3.ZF-ATF轉染HUVEC細胞后抑制了其增殖能力,增強了遷移能力。
　　4.ELISA法檢測結果表明,LPS刺激前后,空載組及空白組細胞因子表達存在統(tǒng)計學差異,LPS刺激后均明顯上調(空白組IL-6:126±28.8vs738±70.1,IL-8:110±33.9vs724±72.3,TNF-α:9.8±1.5vs41±8.9,P<0.05

9、;空載體組:IL-6:134±11.4vs712±110.3,IL-8:110±29.1vs762±10.6,TNF-α:7.6±2.3vs42±9.1P<0.05),ZF-ATF轉染組細胞因子也有明顯上調(IL-6:130±35.4vs292±44.9,IL-8:96±18.2vs328±76.3,TNF-α:7.2±2.6vs21±4.2P<0.05),但ZF-ATF轉染組細胞因子的上調水平?jīng)]有空白組及空載組上調水平高,存在統(tǒng)計學差

10、異(IL-8、IL-6P<0.01,TNF-αP<0.05),ZF-ATF轉染組與空白組比較細胞因子表達存在統(tǒng)計學差異(IL-8、IL-6P<0.01,TNF-αP<0.05),而空載組與空白組比較LPS刺激前后細胞因子的表達均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Westernblot證實在LPS刺激后ZF-ATF轉染組NF-κBp65的表達(19.8±4.5)較空載組(90.2±5.9)及空白組(96.3±3.3)顯著下調(P<0.01)。