三七皂苷及其單體配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能、單核-內(nèi)皮黏附的影響與機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人們的健康。研究表明血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的先決條件及重要機(jī)制。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作為AS發(fā)生的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一，可引起血管內(nèi)膜損傷，誘導(dǎo)各種黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)單核細(xì)胞與動(dòng)脈內(nèi)膜的黏附、遷移并吞噬脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞，這些病理變化在人類動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中起

2、到非常關(guān)鍵的作用。因此，保護(hù)內(nèi)皮、抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附是AS防治的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明，三七總皂苷(total saponisns of Panax notoginseng，PNs)作為三七的主要有效成分，對(duì)多種心血管疾病均有良好的防治作用，且安全無明顯毒副作用。我室研究也表明，PNS可以有效防治動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。目前已從PNS中分離并鑒別到20余種單體成分，根據(jù)其皂單元的不同，分為三醇型和二醇型。在PNS

3、的復(fù)雜成分中，到底是哪些單體分子在發(fā)揮作用，它們之間的相互關(guān)系如何?迄今為止，尚未見有關(guān)單體間相互作用的研究?？紤]到PNS具有明確的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、而內(nèi)皮在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，本實(shí)驗(yàn)擬從AS發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)內(nèi)皮損傷及單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附入手，旨在研究PNS抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)理，深入闡明PNS抗AS的物質(zhì)基礎(chǔ)，為尋找有效的抗AS藥靶組合及中藥配伍機(jī)理的研究開辟新的領(lǐng)域。 方法 1．采用酶消化法體

4、外原代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，human umbilical veinendothelial cells)，以形態(tài)學(xué)觀察和Ⅷ因子免疫熒光法進(jìn)行鑒定。 2．ox-LDL處理HUVEC造成損傷，通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT測(cè)定細(xì)胞活性、檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH釋放量，硝酸還原酶法和放射免疫法測(cè)定HUVEC培養(yǎng)上清液中NO、ET含量，觀察不同濃度PNS對(duì)HUVEC損傷的保護(hù)作用。 3．ox-LDL處理HUVEC后，加入人單核株

5、THP-1與HUVEC共培養(yǎng)1h，通過形態(tài)學(xué)觀察THP-1與HUVEC黏附，采用蛋白染料染色法測(cè)定黏附值，觀察不同濃度PNS及三七皂苷單體對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的單核．內(nèi)皮細(xì)胞黏附的抑制作用。 4．正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三七皂苷單體配伍組合，通過單核．內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)篩選最佳單體配伍組合。 5．RT-PCR方法測(cè)定ICAM-1的mRNA表達(dá)；Western-blot方法測(cè)定ICAM-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1．ox-LDL

6、(100μg/ml)可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，可見細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞收縮，胞膜皺縮，邊界不清，折光性降低，部分細(xì)胞脫落，細(xì)胞活性明顯下降。PNS不同濃度均可改善ox-LDL的損傷，提高細(xì)胞存活率(P<0.01)。 2．PNS各劑量組與ox-LDL組相比，均能顯著降低LDH的釋放(P<0.01)。 3．PNS高劑量組可使HUVEC培養(yǎng)上清液中NO含量升高，ET含量降低，與ox-LDL組比較有顯著性差異。NO在中劑量有顯著性差異(P<

7、0.01)，低劑量無顯著性差異。ET在PNS低、中劑量變化不明顯。 4．ox-LDL組單核細(xì)胞的黏附率顯著增加(P<0.01)，PNS對(duì)其具有明顯的劑量依賴性抑制作用。 5．正交實(shí)驗(yàn)表明，三七皂苷單體Rg<,1>、Rb<,1>、R<,1>是PNS中影響單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附的三個(gè)主要因素，且三者之間存在著交互作用，最佳單體配伍組合是：Rg<,1>(10<'-5>mol/L)、Rb<,1>(10<'-4>mol/L)、R<,

8、1>(10<'-5>mol/L)。 6．ox-LDL組與正常對(duì)照組相比，ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，PNS各劑量組及單體組合組均能下調(diào)ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論 1．ox-LDL(100μg/ml)可造成HUVEC結(jié)構(gòu)和功能損傷。PNS對(duì)ox-LDL，導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，并能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞。NO、ET分泌，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 2．PNS可能通過

9、下調(diào)ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)而抑制單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，提示：PNS抑制由單核細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜的遷移，進(jìn)而阻斷泡沫細(xì)胞及AS斑塊形成，是其發(fā)揮防治AS的重要機(jī)制所在。 3．在本實(shí)驗(yàn)體系中，保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制單核-內(nèi)皮黏附的最佳PNS單體組合為：Rg<,1>：Rb<,1>：R<,1>為1：10：1(Rg<,1> 10<'-5>mol/L、Rb<,1> 10<'-4>mol/L、R11Omol/L)，此最佳單體組合能