阿托伐他汀對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響及其作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的：利用腫瘤壞死因子-a（TNF-a）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，通過(guò)細(xì)胞黏附試驗(yàn)觀察阿托伐他?。ˋTV）干預(yù)后脂質(zhì)過(guò)氧化內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞（U937）發(fā)生黏附的改變，并分別從ATV對(duì)HUVEC表面細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)量及單分子ICAM-1與其配體CD11b相互作用力的影響兩方面進(jìn)一步探討ATV調(diào)脂外的抗炎作用機(jī)制。
　　 方法：以0.1％Ⅰ型膠原酶37℃消化15-20min

2、人臍靜脈內(nèi)皮，分離獲得的原代HUVEC用低血清內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代；用Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定HUVEC，將第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1、單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)
　　 將HUVEC接種于96孔板，分組實(shí)驗(yàn)：①.Control（對(duì)照組）；②TNF-a（TNF-a10ug/L）；③.TNF-a+ATV（TNF-a10ug/L+ATV10μmol/l）。（TNF-a10ug/L孵育2

3、4小時(shí)后，與ATV共同孵育24小時(shí)）。25％Rose Bengal染色法檢測(cè)HUVEC與單核U937細(xì)胞黏附情況，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔A值，單核細(xì)胞攝取的Rose Bengal染料在PBS-乙醇作用后釋放出來(lái)，每孔A值與所粘附的單核細(xì)胞數(shù)量成正比。
　　 2、ATV干預(yù)對(duì)HUVEC表面ICAM-1表達(dá)的影響
　　 將HUVEC接種至6孔板，分組如上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束收獲細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入流式管內(nèi)，PBS洗細(xì)胞1次，

4、利用剩余上清液制成細(xì)胞懸液（約100ul），每管內(nèi)加入10ul FITC標(biāo)記的ICAM-1單克隆抗體，PBS洗細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)，每次記數(shù)15000個(gè)細(xì)胞，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度表示。
　　 3、融合表達(dá)載體ICAM-1-GFP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞
　　 從體外培養(yǎng)的HUVEC中提取總RNA，以pEGFP-N1為模板，設(shè)計(jì)合成一端含有BamHI酶切位點(diǎn)，另一端將含有HindⅢ酶切位點(diǎn)的

5、一對(duì)PCR引物（上游和下游引物序列如下：ICAM-UPPER：5'CCA AGC TTC CTC GCT ATG GCT CCC AGC AG3'；ICAM-LOWER：5'CTG GAT CCA AGG GAG GCG TGG CTT GTG TGT T3'），RT-PCR擴(kuò)增獲得ICAM-1cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行DNA測(cè)序。將ICAM-1的騙碼區(qū)cDNA與pEGFP-N1進(jìn)行酶切，構(gòu)建GFP與ICAM-1的C末端連接的表達(dá)載

6、體并行雙酶切鑒定。構(gòu)建好的質(zhì)粒ICAM-1-GFP通過(guò)脂質(zhì)體（lipofectamine2000）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光。
　　 4、AFM測(cè)定ICAM-1與CD11b的單分子力譜
　　 AFM探針以標(biāo)準(zhǔn)程序清潔后，室溫下于MPTMS孵育2小時(shí)將其硅烷化。用一段長(zhǎng)約20-40nm的聚乙烯二醇（PEG）作為間隔物，其活性胺基末端和活性巰基末端分別連接人重組C

7、D11b蛋白及AFM探針針尖。
　　 將質(zhì)粒ICAM-1-GFP經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，分組測(cè)力：①不予任何藥物干預(yù)（Transfected Cell）；②ATV10μmol/l孵育修飾有CD11b蛋白的AFM針尖1小時(shí)（Tip+ATV）；③ATV10μmol/l孵育轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞1小時(shí)（ICAM-1-Cell+ATV）；④給予抗人ICAM-1單克隆抗體200ug/ml孵育轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞1小時(shí)（ICAM-1-Cel

8、l+Anti）。對(duì)熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞所獲得的ICAM-1熒光融合蛋白聚集區(qū)在2.0±0.5×103pN/s的加載速率范圍下，令CD11b修飾的AFM探針?lè)磸?fù)在細(xì)胞表面下壓-回拉，隨機(jī)獲得力-距離曲線，統(tǒng)計(jì)得出針尖和細(xì)胞間親和力的高斯分布及成鍵幾率。
　　 結(jié)果：
　　 1、TNF-a誘導(dǎo)組HUVEC與單核U937黏附較對(duì)照組明顯增多（P<0.05），而ATV干預(yù)組的單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附較TNF-a組減少（P<0.05

9、）。
　　 2、TNF-a誘導(dǎo)組較對(duì)照組HUVEC表面ICAM-1表達(dá)量增多（P<0.05），而ATV干預(yù)則下調(diào)TNF-a誘導(dǎo)的HUVEC表面ICAM-1表達(dá)量的增多（P<0.05）。
　　 3、DNA測(cè)序及雙酶切鑒定表明融合表達(dá)質(zhì)粒ICAM-1-GFP的構(gòu)建成功，且通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（×1000）觀察ICAM-1綠色熒光融合蛋白定位在COS-7細(xì)胞膜表面。
　　 4各組AFM測(cè)力及成鍵幾率結(jié)果分別為：①Tra

10、nsfected Cell：42.04±0.6pN；19.15±4.2％②Tip+ATV：40.04±0.7pN；20.02±2.6％③ICAM-1-Cell+ATV：39.68±1.3pN；23.76±2.5％④ICAM-1-Cell+Anti：27.56±0.6pN；15.70±3.5％。前3組測(cè)得ICAM-1與CD11b作用力值及成鍵幾率比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），而第4組與前3組比較力值降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<

11、br>　　 結(jié)論：
　　 1、TNF-a誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化增加了其與單核細(xì)胞U937發(fā)生黏附，而ATV干預(yù)有效抑制了TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附的發(fā)生。
　　 2、正常HUVEC膜表面僅有少量ICAM-1表達(dá)，應(yīng)用TNF-a誘導(dǎo)可大幅上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)，而ATV則有效抑制了ICAM-1表達(dá)增加。
　　 3、ICAM-1與GFP重組質(zhì)粒ICAM-1-GFP的成功構(gòu)建不影響ICAM-1的膜定位及黏