阿托伐他汀對(duì)人外周血培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響.pdf

1、背景與目的
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞( Endothelial Progenitor Cells，EPCs)廣泛存在于臍血、胎肝、骨髓及外周血等多種組織中。它能夠介導(dǎo)缺血組織區(qū)域血管新生，參與損傷內(nèi)皮修復(fù)，抑制血管修復(fù)時(shí)內(nèi)膜的過(guò)度增厚。EPCs用于細(xì)胞移植時(shí)，較少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，為研究者所關(guān)注。研究表明，部分老齡、冠心病、糖尿病、高血壓病及嚴(yán)重的肺動(dòng)脈高壓患者體內(nèi)EPCs數(shù)量下降及功能不全，將EPCs進(jìn)行自體移植，能夠取得較好的臨床治

2、療效果。由于從外周血中獲取EPCs十分方便，且來(lái)源充足，因此，通過(guò)外周血中分離培養(yǎng)EPCs成為研究熱點(diǎn)之一。但是，目前在體外培養(yǎng)的EPCs存在諸多缺點(diǎn)，如自身增殖能力低、較早出現(xiàn)復(fù)制性衰老等，從而限制了EPCs的應(yīng)用。如何改進(jìn)培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出數(shù)量充足、粘附及遷移功能強(qiáng)的EPCs則顯得尤為重要。阿托伐他汀除具有降脂，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制血小板聚集，降低C反應(yīng)蛋白的作用外，還能夠改善血管內(nèi)皮功能。因此，本研究通過(guò)分離人外周血

3、EPCs，并應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)培養(yǎng)，觀察其對(duì)EPCs體外培養(yǎng)數(shù)量及功能的影響，探索改良人外周血EPCs體外培養(yǎng)的新途徑，為EPCs自體移植創(chuàng)造條件。
　　 方法：
　　 1、分離：采用密度梯度離心法分離成人外周血單個(gè)核細(xì)胞；
　　 2、分組：設(shè)普通培養(yǎng)基組為對(duì)照組（A組，不含阿托伐他汀組）。將分別含濃度為1×10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、104mol/L阿托伐他汀培養(yǎng)基組為干預(yù)B、C

4、、D、E組；
　　 3、培養(yǎng)擴(kuò)增：將分離出的單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞同步化（細(xì)胞濃度調(diào)到5×106/L）后接種于預(yù)先包被人纖維連接蛋白(h-FBN)的6孔培養(yǎng)皿，分別在阿托伐他汀干預(yù)組（B、C、D、E組）及普通培養(yǎng)基（A組）中培養(yǎng)，7d后收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行分析；
　　 4、鑒定：激光共聚焦顯微鏡下觀察，Dil-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs，并細(xì)胞計(jì)數(shù)；
　　 5、分別采用改良的Boy

5、den chamber小室法、細(xì)胞離壁培養(yǎng)法在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各組(A、B、C、D、E組)遷移、粘附細(xì)胞數(shù)目。比較各組間細(xì)胞的遷移、粘附能力。
　　 結(jié)果：
　　 1、應(yīng)用密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，差速貼壁分離純化獲得EPCs。
　　 2、鑒定：培養(yǎng)7d后形成以梭形為主的內(nèi)皮樣細(xì)胞，呈鵝卵石樣鑲嵌排列；在激光共聚焦顯微鏡下DiL-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs。

6、
　　 3、阿托伐他汀干預(yù)組（B、C、D、E組）與對(duì)照組（A組）相比，體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量、粘附及遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著增多。B、C、D、E4組比較，EPCs的數(shù)量、粘附及遷移細(xì)胞數(shù)目均呈遞增樣改變。
　　 結(jié)論：
　　 1、Ficoll密度梯度離心結(jié)合二次貼壁法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、易行，可得到的較高純度EPCs，且獲得的單個(gè)核細(xì)胞并未完全脫離其他細(xì)胞相互作用的微環(huán)境，EPCs增殖能力較好。密度梯度