阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮功能及脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α的影響.pdf

1、研究背景：
　　 膿毒癥(Sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群,也是危重病人死亡的主要因?yàn)橹?臨床主要表現(xiàn)為系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)與多器官功能不全(Multiple organ dysfunctionsyndrome,MODS)。其病理過(guò)程復(fù)雜,涉及大量細(xì)胞、炎性介質(zhì)與凝血系統(tǒng)的激活。革蘭氏陰性菌(G-)感染是引起膿毒癥的重要因?yàn)橹?/p>

2、一,其外膜的活性成分內(nèi)毒素即脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)與宿主細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體TLR2和TLR4(toll-like receptor,TLR)結(jié)合,啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng),引起多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放。內(nèi)毒素可激活補(bǔ)體與凝血系統(tǒng),促激肽產(chǎn)生,并刺激單核巨噬細(xì)胞生成白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TN

3、F-α)等細(xì)胞因子,在膿毒癥的病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。細(xì)菌破裂時(shí),LPS被釋放出來(lái),廣泛作用于機(jī)體多組織器官,其中內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞。在LPS刺激下,它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(Cytokin storm),眾多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)前炎癥細(xì)胞因子TNF-α是膿毒癥和膿毒癥休克發(fā)病的重要介質(zhì),巨噬細(xì)胞是膿毒癥TNF-α產(chǎn)生的主要來(lái)源,大量TNF-α的產(chǎn)生可引起多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)和釋

4、放,進(jìn)而引起失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括出血、白細(xì)胞侵潤(rùn)、血管擴(kuò)張和血漿蛋白滲出、水腫等,導(dǎo)致微循環(huán)障礙、有效循環(huán)血量減少,最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙。因此,臨床控制LPS引起的炎癥反應(yīng)成為膿毒癥治療的重要方面,也是該領(lǐng)域重要的研究課題。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種多因素疾病,多年來(lái)曾有多種學(xué)說(shuō)如脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、受體缺失學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)等從不同角度來(lái)闡述其發(fā)病機(jī)制,根據(jù)不

5、同的學(xué)說(shuō)也孕育了動(dòng)脈粥樣硬化性疾病(Atheroscleroticdiseases,ASD)不同的治療方法。目前認(rèn)為AS各種主要危險(xiǎn)因素最終都通過(guò)損傷動(dòng)脈內(nèi)膜來(lái)啟動(dòng)和促進(jìn)AS,AS也即是動(dòng)脈對(duì)血管內(nèi)膜損傷作出的炎癥纖維增生性反應(yīng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著極為重要的角色,包括炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞的形成、內(nèi)皮功能的障礙、脂質(zhì)條紋(斑塊)的出現(xiàn)、乃至最終冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生等均和炎癥密切相關(guān)。內(nèi)皮是血管的重要保

6、護(hù)屏障,血管內(nèi)皮功能障礙作為AS病理過(guò)程中的一個(gè)早期全身性改變,和巨噬細(xì)胞等參與的炎癥反應(yīng)貫穿著AS發(fā)生、發(fā)展的全部過(guò)程,是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)生的核心環(huán)節(jié),也是該類(lèi)疾病防治的主要靶點(diǎn)之一。
　　 心腦血管疾病目前已超越腫瘤性疾病成為人類(lèi)的第一殺手,而動(dòng)脈粥樣硬化則是心腦血管疾病的最主要因?yàn)?雖然甘前的治療方法不斷進(jìn)展,但其發(fā)病率和住院率仍呈逐年上升趨勢(shì),而膿毒癥患者存在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)疾病或的動(dòng)脈硬化性疾病合并膿毒癥的患者在臨

7、床上也日益增多。膿毒癥的治療一直是危重病領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn),而對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化性疾病患者出現(xiàn)膿毒癥的治療因?yàn)樘幱谖Ｖ夭『托难芗膊〉膶W(xué)科交叉領(lǐng)域因而一直未受到特別的關(guān)注。盡管近年來(lái)膿毒癥的治療取得了一定的進(jìn)展,但膿毒癥的死亡率仍然居高不下,而動(dòng)脈硬化性疾病基礎(chǔ)上合并膿毒癥則進(jìn)一步增加了其死亡率。因此,如何在現(xiàn)有的治療條件下探索新的治療藥物和方法以縮短該類(lèi)患者的住院時(shí)間和降低其致殘率和死亡率是一個(gè)值得深入研究的課題。然而,新藥的研發(fā)需要

8、漫長(zhǎng)的研究過(guò)程和巨額的研究費(fèi)用。因此,近年來(lái),探索現(xiàn)有藥物新的治療用途也日益成為一個(gè)研究方向。
　　 他汀類(lèi)藥物即羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑是目前臨床廣泛使用也是最為重要的調(diào)脂藥物,是降低血脂并降低心腦血管事件的關(guān)鍵藥物之一。目前認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,它與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制有著很多相似之處。近年來(lái)的研究表明,他汀類(lèi)藥物不但具有降脂效應(yīng),還具有抗炎、抗氧化、抗栓等功能,后者被認(rèn)為是他汀類(lèi)藥物的非降脂

9、效應(yīng)。有許多研究表明,他汀類(lèi)藥物對(duì)心臟的保護(hù)作用并非主要來(lái)自其降脂效應(yīng),其抗炎效應(yīng)在其中扮演著極為重要的作用。因此,他汀類(lèi)藥物作為降脂藥物的同時(shí),也被視為抗炎藥物的杰出代表,各領(lǐng)域?qū)ζ溲芯恳仓鸩缴钊搿Ｄ摱景Y作為一種炎癥反應(yīng)性疾病,而他汀類(lèi)藥物具有廣泛的抗炎癥效應(yīng),因此,他汀類(lèi)藥物通過(guò)調(diào)控炎癥網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),從而達(dá)到抗膿毒癥效應(yīng)成為一種可能。多倫多一項(xiàng)新的回顧性分析證明,他汀類(lèi)藥物的多效性可能有助于預(yù)防心血管疾病患者發(fā)生

10、膿毒癥。近來(lái)有一些小規(guī)模臨床研究也表明,他汀類(lèi)藥物對(duì)膿毒癥患者、感染性休克患者預(yù)后具有重要保護(hù)作用。這進(jìn)一步提示他汀類(lèi)藥物可能對(duì)合并動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的膿毒癥患者具有很好的治療效果。但目前尚缺乏這方面的臨床和基礎(chǔ)研究。
　　 血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)是一種血紅素降解的催化酶,在蛋白二硫化物還原酶(Protein-disulfide reductase,NADPH)和細(xì)胞色素P-450還原酶及分

11、子氧作用下,HO-1催化血紅素降解為膽綠素、一氧化碳(Carbonmonoxide,CO)和鐵,前者還原成膽紅素后具有很強(qiáng)的抗氧化能力,后者是一種重要的信使分子。近年研究發(fā)現(xiàn),HO-1及其酶解產(chǎn)物膽紅素、CO、轉(zhuǎn)鐵蛋白共同發(fā)揮著抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡和改善組織微循環(huán)等作用,廣泛參與心、腦、肺、肝、腎等組織細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷,是機(jī)體最熏要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一,尤其是其組織器官的保護(hù)作用已逐漸成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。HO-1是一種保護(hù)

12、因子,其抗炎、抗凋亡、抗增生作用在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和其他細(xì)胞研究中已得到證實(shí)。因此,HO-1通路介導(dǎo)的抗炎癥效應(yīng)也被認(rèn)為是膿毒癥治療的有效途徑。
　　 本課題擬對(duì)阿托伐他汀對(duì)炎癥相關(guān)的血管內(nèi)皮功能障礙的影響及其對(duì)脂多糖介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)效應(yīng)進(jìn)行研究,并探討該效應(yīng)是否由HO-1通路介導(dǎo),為明確阿托伐他汀在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病合并膿毒癥治療中的價(jià)值奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　 第一章 阿托伐他汀對(duì)高脂飲食

13、兔血管內(nèi)皮功能障礙的影響
　　 目的：通過(guò)高脂飲食建立新西蘭兔的高脂血癥和血管內(nèi)皮功能障礙模型,評(píng)價(jià)炎癥在其中的作用和阿托伐他汀的干預(yù)效應(yīng)。
　　 方法:16只新西蘭兔給予高脂飲食,隨機(jī)分為單純高脂飲食組(CTL組,無(wú)藥物干預(yù))和阿托伐他汀組(ATV組,高脂飲食聯(lián)合阿托伐他汀),分別測(cè)定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL.C)、甘油三酯(TG)、C.反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、

14、內(nèi)皮素-1(ET-1)、無(wú)創(chuàng)超聲評(píng)價(jià)的血管內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)水平。8周后再次復(fù)查上述參數(shù)并在ATV組同時(shí)撤去阿托伐他汀和高脂飲食,并分別于撤藥1、4、7天后再次測(cè)定上述參數(shù)。
　　 結(jié)果:8周的高脂飲食可使血脂和炎癥標(biāo)記物(CRP,IL-6)的水平明顯升高,導(dǎo)致ET-1/NO的失衡并引起內(nèi)皮功能障礙。阿托伐他汀治療能顯著抑制該效應(yīng),但并不能將其控制到基線(xiàn)水平。阿托伐他汀撤藥1、4、7天后未能引起明顯的血脂水平變化,但4天和7天后炎癥

15、標(biāo)志物水平明顯升高,且內(nèi)皮功能障礙加重,該效應(yīng)獨(dú)立于血脂水平的變化。
　　 結(jié)論:高脂飲食能引起內(nèi)皮功能障礙及炎癥反應(yīng)的增強(qiáng),阿托伐他汀能顯著地反向調(diào)節(jié)該效應(yīng)。終止阿托伐他汀治療可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的反彈增強(qiáng)并使內(nèi)皮功能障礙加重,該效應(yīng)獨(dú)立于血脂水平的變化而與炎癥密切相關(guān)。
　　 第二章 阿托伐他汀對(duì)脂多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)及分泌的影響
　　 目的：了解阿托伐他汀對(duì)LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)及分

16、泌的影響和可能機(jī)制。
　　 方法:小鼠巨噬細(xì)胞株復(fù)蘇后穩(wěn)定傳3代后作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力,酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunospecific assay,ELISA)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的水平,定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、HO-1的mRNA表達(dá),Westernblot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:(1)阿托伐他汀能顯著提高RAW 264.7細(xì)胞HO-1的mRNA