前荷葉堿單體的分離鑒定及其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血流與平滑肌細(xì)胞之間，其損傷和/或功能改變在多種心血管疾病的發(fā)病過程中起重要作用，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為一氧化氮(NO)等內(nèi)皮依賴性舒張因子(EDRF)分泌減少或生物利用度降低，而內(nèi)皮素(ET)等內(nèi)皮依賴性收縮因子(EDCF)分泌增多。目前認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡在內(nèi)皮功能障礙中起重要的作用。引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘因有很多，其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO失衡導(dǎo)致細(xì)胞凋亡

2、越來越受到人們的關(guān)注。故對NO水平進(jìn)行調(diào)控可望成為治療AngⅡ引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡異常相關(guān)心血管疾病的有效策略。目前已發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑均可提高內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO水平。 我國傳統(tǒng)中藥有作用溫和、副作用少的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)一種有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，且能進(jìn)一步改善甚至逆轉(zhuǎn)心血管疾病發(fā)病進(jìn)程的藥物具有深遠(yuǎn)意義。蓮子心為睡蓮科植物睡蓮成熟種子中的干燥幼葉及胚根，是祖國醫(yī)學(xué)中重要藥物之一，具有清心安神、去

3、熱，交通心腎、澀精止血之功效。自從日本人富田真雄等從蓮葉中分離出荷葉堿(Nuciferine)、蓮堿(Roemerine)、O-去甲荷葉堿(O-Nornuciferine)3個(gè)單體成分以來，迄今為止，從植物蓮中分離出的生物堿類化合物已有20多個(gè)，且均為異喹啉類生物堿。前荷葉堿(Pronuciferine)是從蓮子心中提取的原阿樸啡生物堿，到目前為止，除了有學(xué)者曾報(bào)道從蓮子心中提取得到了前荷葉堿外，國內(nèi)外對其的生物學(xué)功能尚無研究。而從蓮子

4、心中提取出來的蓮心堿和甲基蓮心堿可阻滯鈣離子通道、清除氧自由基、抑制血小板聚集，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。由此推測前荷葉堿可能也具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。 在本研究中，我們從蓮子心中分離鑒定了前荷葉堿單體，并研究了其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)功能的影響，具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：一前荷葉堿單體的分離鑒定。 方法：1.蓮子心超臨界CO2萃取物化學(xué)成分分析。采用超臨界CO2萃取技術(shù)從蓮子心中提取親脂性成分，并用氣相

5、色譜-質(zhì)譜(GC-MS)計(jì)算機(jī)連用技術(shù)分離鑒定了其中的化學(xué)組成。 2.前荷葉堿單體的分離鑒定。將上述萃取物用柱層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，并對得到的單體化合物用高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、GC-MS進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：1.在設(shè)定的超臨界CO2萃取條件下，萃取物得率為2.5％，其中含有前荷葉堿等14種成份。 2.柱層析分離可獲得單一成分，經(jīng)鑒定為前荷葉堿單體，其總得率為0.0154‰。 結(jié)論：用超

6、臨界CO2萃取技術(shù)，結(jié)合柱層析分離純化，可得到蓮子心中的前荷葉堿單體，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 二前荷葉堿對HUVECs功能的影響。 方法：體外培養(yǎng)HUVECs。 1.設(shè)立空白對照組(不加藥)、硝苯地平組(10μmol/L)、前荷葉堿組(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L)，每組6個(gè)復(fù)孔，分別作用于HUVECs，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)胞形態(tài)，M

7、TT法觀察前荷葉堿對HUVECs活性的影響，化學(xué)比色法測定各組的NO、總NOS(tNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。 2.設(shè)立空白對照組(不加藥)、AngⅡ組(1μmol/L)、卡托普利+AngⅡ組(卡托普利10μmol/L孵育30分鐘后，加入AngⅡ1μmol/L)、前荷葉堿組+AngⅡ組(前荷葉堿分別為100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L，分別孵育30分鐘后，加入A

8、ngⅡ1μmol/L)，各組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法觀察細(xì)胞活性，化學(xué)比色法測定各組的NO、tNOS、iNOS，流式細(xì)胞儀測定各組的細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：1.與空白對照組比較，前荷葉堿對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和活性無明顯影響，0.01～10μmol/L前荷葉堿和10μmol/L尼群地平均可顯著增加NO生成(P＜0.01)，100μmol/L則作用不明顯，0.01～1μmol/L前荷葉堿呈濃度依賴性增加NO生成，1～10

9、0μmol/L則呈下降趨勢。0.01～10μmol/L前荷葉堿和10μmol/L尼群地平明顯增加tNOS活性(P＜0.01)，100μmol/L前荷葉堿則對tNOS活性無明顯影響，各組對iNOS的表達(dá)均無明顯影響。 2.與空白對照組比較，AngⅡ能明顯降低細(xì)胞活性，誘導(dǎo)HUVECs的凋亡(P＜0.01)；輕度減少tNOS活性及NO的生成，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.01～10μmol/L前荷葉堿和10μmol/L卡托普利可增強(qiáng)HUV

10、ECs分泌NO及tNOS活性(P＜0.05)，100μmol/L前荷葉堿能少量增加NO及tNOS活性，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組對iNOS影響不大。0.01～10μmol/L前荷葉堿和10μmol/L卡托普利能使AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs的活性明顯改善，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。100μmol/L前荷葉堿作用不顯著。 結(jié)論：低濃度前荷葉堿可通過增加tNOS尤其是eNOS活性而提高HUVECs釋放NO，可能通過該途徑保護(hù)內(nèi)