尾加壓素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、背景： 心血管疾病是當(dāng)今危害人類健康的常見病，近年來隨著人們對心血管疾病的實驗和臨床研究不斷深入，血管活性物質(zhì)在其中作用的研究已取得很大進(jìn)展，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)的研究越來越深入，這對于揭開心血管疾病的發(fā)病機制起到了積極的推動作用。尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)最早是從魚的脊髓尾部下垂體中分離出的生長抑素樣環(huán)肽，后來證實從軟體動物到哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)均有存在。1999年Ames等發(fā)現(xiàn)，心血管組織中富含U

2、Ⅱ，并且人體中有UⅡ的特異性受體，即一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體GPR14，主要分布于心血管系統(tǒng)(血管平滑肌、內(nèi)皮、心肌和冠狀動脈粥樣硬化斑塊)，與鼠的GPR14同源性，UⅡ與GPR14結(jié)合后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]升高，引起心功能抑制、血管收縮等一系列心血管效應(yīng)，其縮血管效應(yīng)比內(nèi)皮素-1(ET-1)強10余倍，是目前已知的在哺乳動物體內(nèi)最強的縮血管物質(zhì)，并具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞分裂增殖的作用。UⅡ是目前心血管系統(tǒng)研究領(lǐng)域的熱

3、點之一。細(xì)胞凋亡是機體的一種基本生理機制，它貫穿于整個生命過程，為機體正常細(xì)胞的更新與異常細(xì)胞的清除提供了可能。細(xì)胞凋亡是正常的生理性死亡，與細(xì)胞增殖之間保持著一種動態(tài)平衡，只有當(dāng)細(xì)胞凋亡不足或過多的時候才能成為一種致病因素，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不可能發(fā)生凋亡，只有壞死才是心肌細(xì)胞的唯一死亡方式。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明：動物心血管疾病模型和心血管患者人群的病理條件可以引起心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。由于平滑

4、肌和內(nèi)皮細(xì)胞暴露在具有生理活性的環(huán)境因素下，受多種因素的調(diào)節(jié)包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞在這些因素的作用下產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡在許多疾病中都起著非常關(guān)鍵的作用，現(xiàn)已證明它在心肌梗死、心臟缺血或缺血/再灌注、動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著不可忽視的作用。其中，引起動脈粥樣硬化的相關(guān)因素，如：氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、血小板的激活、血管緊張素Ⅱ增多、高血壓、輻射、腫瘤壞

5、死因子(TNF)、IL家族、內(nèi)毒素、氧自由基等均可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡發(fā)生后，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少，影響內(nèi)皮再生，加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。ox-LDL也可引起血管平滑肌損害，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞防血脂沉積屏障作用減弱，覆蓋在血管壁的凋亡平滑肌細(xì)胞(VSMC)發(fā)生凋亡，最后導(dǎo)致粥樣斑塊破裂。另外，受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞引發(fā)VSMC大量增殖，這也是促使動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵因素。所以，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC的完整，避免凋亡的發(fā)生，

6、不失為治療動脈粥樣硬化的一種有效途徑。這或許能從凋亡的視角為抗動脈粥樣硬化治療提供新的思路。經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后最主要的并發(fā)癥是約有30％的患者在術(shù)后6個月內(nèi)發(fā)生再狹窄，其主要表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的增多。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和VSMC增殖是血管閉塞和PTCA術(shù)后再狹窄(RS)的重要發(fā)病機制。心肌細(xì)胞凋亡機制的明確將給心血管疾病的治療帶來一場新的革命。針對凋亡進(jìn)行藥物控制的治療手段將打開治療心血管疾病的希

7、望之門。本研究以一種新型神經(jīng)內(nèi)分泌激素尾加壓素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響的研究為切入點，觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞的作用尤其對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，從而初步闡述尾加壓素Ⅱ?qū)ρ茏饔玫奶匦浴?目的： 1、用不同濃度的UⅡ加入培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡率的變化及細(xì)胞周期分布，從而研究UⅡ是否能濃度依賴性促進(jìn)HUVEC凋亡。 2、在同一濃度UⅡ作用下，觀察不同時間段的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡率的變化，以確定UⅡ是否能

8、時間促進(jìn)HUVEC的凋亡。 3、在加入一定濃度的鈣離子通道阻滯劑后，探討尾加壓素Ⅱ影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的的可能機制。 方法： 1、光鏡觀察培養(yǎng)的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài) 2、實驗分組(n=7)： (1)用不同濃度的UⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)刺激體外培養(yǎng)的HUVEC，37℃恒溫培養(yǎng)24小時 (2)用同一濃度的UII(10-7mol/L)刺激HUVEC，分別在37℃恒溫

9、培養(yǎng)12、24、48、72小時 (3)將400ng/ml鈣離子拮抗劑硫氮唑酮加入10-7mol/LUⅡ刺激培養(yǎng)的HUVEC中進(jìn)行干預(yù)，與400ng/ml硫氮唑酮組及10-7mol/LUⅡ組進(jìn)行比較，37℃恒溫培養(yǎng)24小時 3、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，計算凋亡率 4、透射電鏡檢測細(xì)胞凋亡 結(jié)果： 1、UⅡ?qū)ε囵B(yǎng)的HUEVC凋亡的影響 1.1UⅡ刺激HUVEC凋亡呈劑量依賴性 不同濃度

10、(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的UⅡ刺激HUVEC時，細(xì)胞凋亡率增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各組之間兩兩比較均存在顯著性差異(P＜0.01)，且隨著UⅡ濃度的增加，凋亡率逐漸增加，一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，10-9～10-6mol/L作用后，與空白對照組比較，G1/G0期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少，兩兩比較顯示，UⅡ濃度越高，該作用越強(P＜0.05)。

11、 1.2UⅡ刺激HUVEC凋亡呈一定的時間依賴性 10-7mol/LUⅡ加入HUVEC作用0h、12、24、48、72h，實驗結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，0-48h細(xì)胞凋亡率呈逐漸增加趨勢，但到72小時凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢，總之，細(xì)胞凋亡率的變化呈一定時間依賴性。 2、UⅡ促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機制 將400ng/ml鈣離子拮抗劑硫氮唑酮加入10-7mol/LUⅡ刺激培養(yǎng)的HUVEC中進(jìn)行干預(yù)，與10-7mo