模擬失重對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、中長(zhǎng)期載人航天飛行中的失重環(huán)境會(huì)對(duì)機(jī)體心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力及立位耐力降低，嚴(yán)重影響航天員的健康及航天任務(wù)的完成。研究表明，失重后立位耐力不良的發(fā)生機(jī)理可能與失重后血容量減少、壓力反射敏感性降低、靜脈順應(yīng)性下降及肌肉萎縮等因素有關(guān)，但其確切發(fā)生機(jī)制仍不清楚。目前認(rèn)為，失重后立位耐力不良的發(fā)生涉及多重復(fù)雜機(jī)制，不論在人體實(shí)驗(yàn)中，還是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，多家實(shí)驗(yàn)室均發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)的變化可能是導(dǎo)致心血管失調(diào)的重要因素。血管收縮功能

2、不良在失重后立位耐力降低的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，但這種血管低反應(yīng)性的確切機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。
　　內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體血管的內(nèi)表面，相互之間密切聯(lián)系而形成一層天然的物理屏障，從而維持著血管壁的完整性。由于其在血管壁中的特殊位置，故內(nèi)皮細(xì)胞可以對(duì)局部血管的血壓、氧分壓及血流變化迅速作出反應(yīng)，通過(guò)合成和分泌多種血管活性物質(zhì)作用于血管平滑肌，從而調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮。一氧化氮（NO）可由體內(nèi)多種組織細(xì)胞分泌，作為一種內(nèi)源性的細(xì)胞

3、內(nèi)信使分子在體內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色，尤其在心血管功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。機(jī)體的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成的，目前發(fā)現(xiàn)的NOS有三種同工酶：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。nNOS和eNOS可在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，主要參與生理水平NO的調(diào)節(jié)；而iNOS在生理狀態(tài)下不表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)因素使其表達(dá)后，會(huì)持續(xù)釋放大量的NO，產(chǎn)生一系列生理及病理作用。有報(bào)道指出內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)失重刺激具有高度敏感

4、性，表現(xiàn)為失重或模擬失重環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞可發(fā)生形態(tài)及基因表達(dá)的改變。大量的研究證明，尾吊模擬失重后大鼠機(jī)體NOS的活性增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，尾吊模擬失重可致大鼠股動(dòng)脈等多種血管系統(tǒng)中出現(xiàn)iNOS的活性及表達(dá)量的增高，并且認(rèn)為失重或模擬失重后內(nèi)皮細(xì)胞釋放的大量非生理濃度的NO是航天后機(jī)體血管收縮不良的重要原因。然而，失重或模擬失重導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)變化及其調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討上述問(wèn)題，我們以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察

5、了回轉(zhuǎn)器模擬失重致HUVEC-CiNOS的表達(dá)變化，進(jìn)而探討了其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究主要結(jié)果與發(fā)現(xiàn)如下：
　　1.模擬失重對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-CiNOS表達(dá)的影響本研究觀察了回轉(zhuǎn)器模擬失重24h對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-CiNOS表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地面靜止對(duì)照組與垂直旋轉(zhuǎn)對(duì)照組iNOSmRNA及蛋白表達(dá)均較低，而24h回轉(zhuǎn)器模擬失重后，HUVEC-CiNOSmRNA及蛋白表達(dá)量顯著增高，表明24h模擬

6、失重可致HUVEC-CiNOSmRNA和蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)。轉(zhuǎn)染了含有7233bp的iNOS啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)phiNOS(7.2)LucHUVEC-C在模擬失重24h后，熒光素酶相對(duì)活性約為1G對(duì)照組的2.29倍，表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24h可致HUVEC-CiNOS在轉(zhuǎn)錄水平被激活。
　　2.模擬失重對(duì)HUVEC-CNF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響本研究利用HUVEC-C轉(zhuǎn)染NF-κB及AP-1報(bào)告基因的方法，觀察了回轉(zhuǎn)器

7、模擬失重24h對(duì)HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與1G對(duì)照組相比，模擬失重可顯著抑制NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性，抑制率為48％；以同樣的方法發(fā)現(xiàn)，回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與1G對(duì)照組相比可顯著抑制AP-1依賴的轉(zhuǎn)錄活性，抑制率為38％。而兩組的陰性對(duì)照質(zhì)粒pCIS-CK轉(zhuǎn)染HUVEC-C后，回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與地面1G對(duì)照組的熒光素酶相對(duì)活性相比無(wú)顯著差別，表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24h可使

8、HUVEC-C中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。
　　3.模擬失重致HUVEC-CiNOS異常表達(dá)機(jī)制的研究本研究通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活性，觀察了模擬失重24h后HUVEC-CiNOS表達(dá)的變化，進(jìn)而明確回轉(zhuǎn)器模擬失重24hHUVEC-CiNOS異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用50μMNF-κB阻斷劑PDTC后模擬失重24h，HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)染熒光素酶啟動(dòng)子

9、報(bào)告基因的相對(duì)熒光量與單純模擬失重組相比未見(jiàn)顯著變化，提示NF-κB未參與模擬失重環(huán)境下HUVEC-CiNOS的異常表達(dá)調(diào)控。應(yīng)用20μMAP-1特異阻斷劑SP600125后與單純模擬失重組相比，HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白及轉(zhuǎn)染了phiNOS(7.2)Luc的相對(duì)熒光量均出現(xiàn)顯著升高，而過(guò)表達(dá)AP-1后，與單純模擬失重組相比HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白表達(dá)及相對(duì)熒光活性均出現(xiàn)明顯抑制。以上結(jié)果提示，模擬失重24h所致的

10、HUVEC-CiNOS表達(dá)的增高部分地與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性降低有關(guān)，而非NF-κB在起作用。
　　4.模擬失重致HUVEC-CiNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)合區(qū)域研究本研究利用構(gòu)建的不同截短長(zhǎng)度的iNOS啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，通過(guò)觀察回轉(zhuǎn)器模擬失重24h后轉(zhuǎn)染了各片段的HUVEC-C相對(duì)熒光量的變化，從而明確模擬失重24h致HUVEC-CiNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子在iNOS啟動(dòng)子上游結(jié)合作用區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染了phiNO

11、S(0.6)Luc和phiNOS(1.0)LucHUVEC-C在模擬失重24h后，HUVEC-C細(xì)胞的熒光素酶活性與1G對(duì)照組相比無(wú)顯著差別，表明iNOS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000bp內(nèi)無(wú)回轉(zhuǎn)器模擬失重24h誘發(fā)iNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　總之，本研究利用細(xì)胞回轉(zhuǎn)器模擬失重效應(yīng)，觀察了模擬失重24h及1G重力環(huán)境下HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白和啟動(dòng)子激活水平的變化，進(jìn)而探討了模擬失重致HUVEC-CiNO

12、S異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。得出了如下結(jié)論：模擬失重24h可致HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白異常表達(dá)及在轉(zhuǎn)錄水平被激活；模擬失重24h可降低HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性；模擬失重24h導(dǎo)致的HUVEC-CiNOS異常表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)，而與NF-κB的活性降低無(wú)關(guān)；iNOS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000bp范圍內(nèi)無(wú)模擬失重24h誘發(fā)HUVEC-CiNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。