瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-kB信號通路及其與鋅指蛋白A20相關(guān)性研究.pdf

1、瘢痕疙瘩(Keloid)是整形外科的常見疾病之一，是人類皮膚受損、創(chuàng)面愈合后局部組織過度纖維化的結(jié)果，常在易感人群中因外傷后發(fā)生，如外科手術(shù)、耳垂穿孔、注射、昆蟲叮咬和燒傷等，臨床上皮損超過原損傷界限，向周圍正常皮膚生長，呈瘤樣增生，故有“蟹足腫”之稱，其好發(fā)于前胸部、肩三角區(qū)、耳部和會陰部。不僅影響人體美觀，而且有不同程度的瘙癢或疼痛、甚至造成功能障礙，給患者帶來極大的心理和生理負(fù)擔(dān)，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響。臨床上局部應(yīng)用藥物治療可暫

2、時緩解癥狀，采用外科手術(shù)切除后，若不綜合抗瘢痕治療，極易復(fù)發(fā)，且向周圍組織外延性生長，因此，瘢痕疙瘩一直是整形外科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。
　　 目前，瘢痕疙瘩的病因?qū)W研究涉及各種因素，包括細(xì)胞因子、生長因子的過表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶降解的失衡，細(xì)胞凋亡的抑制等。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)其確切的形成原因，其組織學(xué)表現(xiàn)為組織過度纖維化、成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)的過度增殖及合成引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matr

3、ix，ECM)的大量沉積。諸多研究結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩發(fā)生的始動細(xì)胞，瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞在基因表達(dá)、增殖凋亡、合成分泌、膠原代謝等方面均發(fā)生了改變，這些改變導(dǎo)致瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞執(zhí)行有別于正常成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能。但是，其發(fā)生促纖維化作用的具體細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)理尚不十分清楚。
　　 核因子—κB(Nuclear faotor KB，NF—κB)是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞內(nèi)許多基因的表達(dá)起著關(guān)

4、鍵性的調(diào)控作用。其信號傳導(dǎo)通路貫穿于創(chuàng)傷修復(fù)與愈合的整個生物學(xué)過程，它是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要傳遞者，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能，并在細(xì)胞纖維化過程中起重要作用；核轉(zhuǎn)錄因子—κB是由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)，以p50/p65異源二聚體最多見。主要介導(dǎo)Rel蛋白與DNA的結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，NF—κB的p65亞基被抑制蛋白IrBs滯留在細(xì)胞質(zhì)中，不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。NF—κB在外來信號刺激下

5、，其抑制性蛋白IkB降解，NF—κB從中解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)特定的DNA序列結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　 鋅指蛋白A20(zinc finger protein A20)是一種能負(fù)性調(diào)控核因子—κB(NF—κB)表達(dá)的基因調(diào)控蛋白，其在抑制NF—κB信號途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中具有重要的作用。目前，關(guān)于NF—κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在瘢痕疙瘩中研究甚少，鋅指蛋白A20的表達(dá)變化及其與NF—κB的相互關(guān)系在瘢痕疙瘩中尚無研究。

6、>　　 本實(shí)驗(yàn)擬以正常皮膚和瘢痕疙瘩為研究對象，通過采用免疫組織化學(xué)染色、體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、提取成纖維細(xì)胞總RNA、采用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)等多種技術(shù)，對鋅指蛋白A20、核轉(zhuǎn)錄因子—κB在瘢痕疙瘩、正常皮膚以及正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)變化進(jìn)行研究，探討核轉(zhuǎn)錄因子—κB信號通路、鋅指蛋白A20對瘢痕疙瘩形成是否具有作用以及其對成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的作用。將為深入研究瘢痕疙瘩的形成機(jī)制、完

7、善調(diào)控瘢痕疙瘩的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、為預(yù)防瘢痕疙瘩的形成和尋找可能作用的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 研究目的
　　 1．檢測鋅指蛋白A20和NF—κB在正常皮膚組織及瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)。
　　 2．了解體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長增殖與體外培養(yǎng)正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞的差異，以及二者進(jìn)入對數(shù)生長期的時間。3．檢測鋅指蛋白A20和NF—κB在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中mRNA的表達(dá)。

8、　　 4．了解核轉(zhuǎn)錄因子—κB信號通路的激活情況及其與瘢痕疙瘩形成的相互關(guān)系，為探索新的預(yù)防和治療瘢痕疙瘩的方法提供思路。
　　 材料
　　 瘢痕疙瘩標(biāo)本共16例，其中男性6例，女性10例，年齡18～42歲，平均32．60±0．38歲，取材部位包括耳垂、前胸等部位，病程為6個月～10年，平均3．40±0．60年。外觀發(fā)紅充血、質(zhì)硬、高出皮膚表面，局部伴瘙癢或疼痛等不適，無感染和潰瘍，未曾應(yīng)用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等

9、方法治療。正常皮膚16例，男9例，女7例，年齡2～54歲，平均年齡23．54±0．42歲。取材部位為上臂內(nèi)側(cè)、腹部全厚植皮術(shù)修剪后剩余皮片。各標(biāo)本均有詳細(xì)的完整病歷和隨訪記錄，所取標(biāo)本之患者無合并皮膚疾病、結(jié)締組織病和其它重要臟器疾?。恍g(shù)前均未行放療、激光治療及免疫治療；所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。
　　 方法
　　 1取人正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織標(biāo)本，制作石蠟切片，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測鋅指蛋白A20和NF—κB的表

10、達(dá)，觀察其在正常皮膚及瘢痕疙瘩中表達(dá)的差異。
　　 2應(yīng)用組織微粒貼壁法，體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞，繪制二者生長曲線，通過細(xì)胞計數(shù)法對體外培養(yǎng)的正常皮膚和瘢痕疙瘩組織成纖維細(xì)胞生長曲線測定比較，了解瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長增殖與正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞的差異，觀察二者進(jìn)入對數(shù)生長期的時間是否相同。
　　 3以瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象，將第4代成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用實(shí)時熒光定

11、量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription—polymerase chain reaction，RT—PCR)技術(shù)檢測NF—κB和鋅指蛋白A20mRNA的表達(dá)，以明確其在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中各自的表達(dá)特征。
　　 結(jié)果
　　 1人正常皮膚組織中和瘢痕疙瘩組織中NF—κB pp65的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，NF—κB p65定位于成纖維細(xì)胞胞漿和胞核，正常情況下呈棕黃色顆粒，胞

12、核幾乎無染色；活化后進(jìn)入核內(nèi)，表現(xiàn)為核染色；NF—κB p65在瘢痕疙瘩中的大部分成纖維細(xì)胞胞核陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為87．50％(14/16)；在人正常皮膚中的大部分成纖維細(xì)胞胞核呈陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率為6．25％(1/16)。二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 2人正常皮膚組織中和瘢痕疙瘩組織中鋅指蛋白A20的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，鋅指蛋白A20染色陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿

13、內(nèi)。鋅指蛋白A20在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞胞漿中呈弱陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為18．75％(3/16)；鋅指蛋白A20在人正常皮膚成纖維細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)中，陽性表達(dá)率為87．50％(14/16)。二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 3體外培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩組織成纖維細(xì)胞生長曲線比較
　　 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長增殖與正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞無明顯差異，二者進(jìn)入對數(shù)生長期的時間大致相同。

14、>　　 4體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞凍存后的復(fù)蘇情況
　　 體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在液氮中凍存后，細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)良好，接種后絕大部分細(xì)胞存活，生長旺盛，存活率達(dá)85％，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與凍存前無明顯差異。
　　 5人正常皮膚成纖維細(xì)胞中和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中NF—κB mRNA的表達(dá)
　　 通過實(shí)時熒光定量RT—PCR顯示：NF—κB mRNA在正常皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量減少，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中NF—

15、κB mRNA的表達(dá)量顯著增加，二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 6人正常皮膚成纖維細(xì)胞中和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中鋅指蛋白A20 mRNA的表達(dá)
　　 通過實(shí)時熒光定量RT—PCR顯示：鋅指蛋白A20 mRNA在正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩的成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，在正常皮膚成纖維細(xì)胞中A20 mRNA的表達(dá)量多于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)量，二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。<

16、br>　　 結(jié)論
　　 1 NF—κB在瘢痕疙瘩組織中的高表達(dá)，說明其信號通路異常可能參與瘢痕疙瘩的形成，并介導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。
　　 2 A20在瘢痕疙瘩中的低表達(dá)，說明瘢痕疙瘩形成機(jī)制可能與A20對核轉(zhuǎn)錄因子—κB的抑制減弱有關(guān)。
　　 3正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞的生長增殖無明顯差異，二者進(jìn)入對數(shù)生長期的時間大致相同。
　　 4瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞及正常皮膚來源的成纖維細(xì)