瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞DNMT1的表達(dá)及5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分:瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞DNMT1的表達(dá)及意義
　　背景與目的:瘢痕疙瘩是整形燒傷外科常見(jiàn)的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制與成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生及膠原的大量無(wú)序沉積有關(guān)，其確切機(jī)制尚不完全清楚。DNA的甲基化與眾多增生性疾病及纖維化性疾病的發(fā)病存在密切的聯(lián)系，而瘢痕疙瘩的發(fā)病是否與DNA甲基化有關(guān)，瘢痕疙瘩甲基化相關(guān)因子的表達(dá)如何目前尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，我們從表觀遺傳學(xué)的角度去探討瘢痕疙瘩發(fā)生的另一種可能的機(jī)制-DNA甲基化，并且可能為瘢

2、痕疙瘩的防治提供新的靶點(diǎn)與切入點(diǎn)。
　　方法:收集53例瘢痕疙瘩患者手術(shù)切取的瘢痕疙瘩及其周?chē)Ｆつw標(biāo)本，并按生長(zhǎng)期分為A（＜6個(gè)月）、B（6～12個(gè)月）、C（1～2年）、D（＞2年）4組;使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，比較各組標(biāo)本正常皮膚、浸潤(rùn)部、增生部及老化部成纖維細(xì)胞DNMT1的表達(dá)差異;RT-PCR法檢測(cè)各組標(biāo)本及不同部位成纖維細(xì)胞DNMT1 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:DNMT1在成纖維細(xì)胞中主要分布于胞核內(nèi);瘢痕疙瘩

3、成纖維細(xì)胞DNMT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及DNMT1 mRNA表達(dá)均高于正常皮膚成纖維細(xì)胞（P=0.001）;瘢痕疙瘩生長(zhǎng)期較短組成纖維細(xì)胞DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率及DNMT1 mRNA表達(dá)均高于生長(zhǎng)期較長(zhǎng)組(P=0.007);位于瘢痕疙瘩浸潤(rùn)部的成纖維細(xì)胞DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率及DNMT1 mRNA表達(dá)均高于增生部與老化部(P=0.001)。
　　結(jié)論:DNMT1在瘢痕疙瘩發(fā)病中具有重要作用;隨著瘢痕疙瘩生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，DNMT1的表達(dá)有降低

4、趨勢(shì);隨著瘢痕疙瘩中部成纖維細(xì)胞老化，DNMT1表達(dá)降低。提示DNMT1在瘢痕疙瘩生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用，并且與瘢痕疙瘩浸潤(rùn)生長(zhǎng)密切相關(guān)。
　　第二部分瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞系的建立及生長(zhǎng)特性研究
　　目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的摸索構(gòu)建瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，初步研究瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，培養(yǎng)足夠的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞為后階段實(shí)驗(yàn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法:采用單細(xì)胞法原代培養(yǎng)

5、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，摸索瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳環(huán)境及培養(yǎng)方法，在顯微鏡下觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，采用MTT法測(cè)定瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)后，約第3天可見(jiàn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，傳代時(shí)間在第15天左右;瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞形態(tài)如同梭形或星形，呈現(xiàn)漩渦狀或者放射狀的排列方式，MTT法測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可作為下一步實(shí)驗(yàn)的資源。

6、>　　結(jié)論:瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)過(guò)程順利，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，我們已成功構(gòu)建瘢痕疙瘩原代及傳代培養(yǎng)的整個(gè)體系，為我們下階段的實(shí)驗(yàn)研究提供了保證。
　　第三部分5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響
　　背景與目的:近年來(lái)，對(duì)瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制及防治的研究越來(lái)越熱，然而對(duì)于瘢痕疙瘩的防治仍是整形燒傷外科的一大難題，第一部分我們已經(jīng)證實(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存在DNMT1的高表達(dá)，因此，表

7、觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化的研究在瘢痕疙瘩的防治中可能有積極意義。本實(shí)驗(yàn)擬探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響，進(jìn)一步探討瘢痕疙瘩與DNA甲基化的關(guān)系及尋找瘢痕疙瘩的治療方法。
　　方法:原代培養(yǎng)人體瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞。使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在干預(yù)前后細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的變化情況。

8、
　　結(jié)果:在同等條件下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期位于G0/G1期細(xì)胞數(shù)（P=0.035）及細(xì)胞凋亡數(shù)(P=0.006)較正常皮膚成纖維細(xì)胞低;5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞停滯于G0/G1期比例增加（P=0.000），并且細(xì)胞凋亡率增加（P=0.047），而正常皮膚成纖維細(xì)胞組均無(wú)明顯變化（P均＞0.05）。
　　結(jié)論:甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可將體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖

9、維細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證明了瘢痕疙瘩的發(fā)生與基因的甲基化密切相關(guān)，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可能成為瘢痕疙瘩防治的新選擇。
　　第四部分5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相關(guān)因子的影響
　　背景與目的:前述研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩的發(fā)生與DNA甲基化存在密切聯(lián)系，并且甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可抑制體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡。

10、因此，我們將進(jìn)一步探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相關(guān)因子DNMT1、TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的作用。
　　方法:常規(guī)原代及傳代培養(yǎng)人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞，使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞干預(yù)時(shí)間為72小時(shí)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)并比較瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維被藥物干預(yù)前后DNMT1、TGF-β1mRNA及Smad7m

11、RNA的表達(dá)水平差異。
　　結(jié)果:體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)組DNMT1、TGF-β1mRNA表達(dá)下降，Smad7mRNA表達(dá)回升，而正常皮膚成纖維細(xì)胞組無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞DNMT1及TGF-β1表達(dá)高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而Smad7表達(dá)低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，在5-氮雜-2-脫氧胞苷的作用下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)趨于正常，5-氮雜-2-脫氧胞苷可能成為瘢痕疙瘩